始旋鏈霉菌普那霉素發(fā)酵及與分離耦合工藝研究.pdf

1、普那霉素是由始旋鏈霉菌產(chǎn)生的一種鏈陽(yáng)性菌素類抗生素，對(duì)包括甲氧西林耐藥的金黃色葡萄球菌、萬古霉素耐藥的腸球菌等在內(nèi)的大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌均具有較強(qiáng)的殺菌活性，且抗生素后效應(yīng)較長(zhǎng)，被專家們視為治療頑固性革蘭氏陽(yáng)性菌感染的特選藥物。目前，普那霉素的生產(chǎn)水平較低，遠(yuǎn)不能滿足臨床上的需求。本文將圍繞如何提高普那霉素的產(chǎn)量和質(zhì)量，對(duì)Streptomyces pristinaespiralis XC416的發(fā)酵工藝、普那霉素的分離純化工藝等進(jìn)行較為系

2、統(tǒng)的研究，并探索采用樹脂吸附的原位分離技術(shù)與發(fā)酵相耦合生產(chǎn)普那霉素的新工藝。 研究了S. pristinaespiralis XC416的搖瓶發(fā)酵條件。通過單因素試驗(yàn)和以響應(yīng)面為主的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：可溶性淀粉65.45g/L，葡萄糖9.30 g/L，豆餅粉10g/L，蛋白胨5g/L，魚粉10g/L，酵母粉3g/L，(NH4)2SO4 1.5g/L，MgSO4·7H2O 4.93 g/L

3、，KH2PO40.2g/L，NaNO30.75g/L，CaCO34g/L。優(yōu)化后的搖瓶培養(yǎng)條件為：種齡48 h，接種量8％，搖瓶裝液量25 mL/250 mL，發(fā)酵初始pH值6.5～7.0，溫度23℃，搖床轉(zhuǎn)速為240rpm。在此條件下，S.pristinaespiralis XC416的搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到了490.7 mg/L。 以生物反應(yīng)與分離耦合的集成化思路為指導(dǎo)，建立了以JD-1大孔吸附樹脂直接從發(fā)酵液中吸附分離目標(biāo)產(chǎn)物的

4、原位分離技術(shù)并禍合普那霉素發(fā)酵的新方法。在S.pristinaespiralis XC416搖瓶發(fā)酵45 h時(shí)添加8％(w/v)JD-1樹脂，普那霉素的產(chǎn)量達(dá)到了1353 mg/L，JD-1樹脂對(duì)普那霉素的吸附容量約為13.5 mg/g。 在5 L發(fā)酵罐上對(duì)S.pristinaespiralis XC416分批發(fā)酵的代謝規(guī)律進(jìn)行了研究，確定了采用分兩階段控制溶氧水平的分批發(fā)酵工藝，使普那霉素的產(chǎn)量達(dá)到了604.mg/L。并在此基

5、礎(chǔ)上建立了普那霉素分批發(fā)酵的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)模型，該模型能較好地反映普那霉素的發(fā)酵過程。同時(shí)以模糊理論為基礎(chǔ)建立了S.pristinaespiralis XC416的模糊生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型，普那霉素發(fā)酵過程的生長(zhǎng)生產(chǎn)耦合度為1.64％，為典型的非生長(zhǎng)耦聯(lián)過程。 建立了對(duì)發(fā)酵液中的普那霉素進(jìn)行分離純化的硅膠柱層析方法。優(yōu)化后的柱層析操作條件為：選用100～200目的硅膠，二氯甲烷：乙酸乙酯：乙醇=80：35：5(V:V)為洗脫劑，流速為2.

6、0 mL/min，普那霉素的進(jìn)樣濃度為2.26g/L，硅膠的總負(fù)載量約為0.81 mg/g，溫度為25℃。在此條件下分離所得產(chǎn)品的純度約為965，回收率約為97％。通過制備高效液相色譜法對(duì)硅膠柱層析分離后得到的產(chǎn)品進(jìn)一步純化精制，最后制備得到了純度在99％以上的普那霉素ⅡA純品，并運(yùn)用紫外光譜、紅外光譜、核磁共振和質(zhì)譜等多種現(xiàn)代波譜學(xué)方法對(duì)所制備的普那霉素ⅡA純品進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定。探索了采用擴(kuò)張床吸附分離異位耦合發(fā)酵生產(chǎn)普那霉素的新工藝。