人卵母細胞玻璃化凍存的安全性與效率研究.pdf

1、成熟卵母細胞凍存是女性生育力儲存目前最成熟并具有前景的技術(shù)，在輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域有其不可替代的優(yōu)勢，并為人類配子及胚胎發(fā)育潛能研究擴展了研究領(lǐng)域。卵母細胞由于其自身特殊的結(jié)構(gòu)特點，在冷凍復(fù)蘇過程中更易受到損傷，細胞骨架、紡錘體、膜結(jié)構(gòu)和透明帶的損傷都影響其復(fù)蘇后受精與胚胎發(fā)育的潛能。卵母細胞冷凍技術(shù)誕生后十余年間一直進展緩慢，玻璃化技術(shù)的成熟與卵母細胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）技術(shù)與的應(yīng)用使其在近十年有了較快發(fā)展，目前有了越來越多的應(yīng)用。

2、但因其安全性仍需更多臨床大樣本和更多基礎(chǔ)研究的論證，卵母細胞冷凍技術(shù)目前仍未成為臨床的常規(guī)操作。卵母細胞冷凍效率的提高和安全性的評估亟需開展，以期更安全、高效地用于臨床。
　　玻璃化冷凍基本原理是通過增加溫度傳導(dǎo)的速度和冷凍保護劑的濃度，使細胞內(nèi)外液由液態(tài)轉(zhuǎn)化為類似玻璃狀的非晶體化固體狀態(tài)，形成透明的玻璃狀固體，保留細胞內(nèi)液體正常的分子和離子分布。玻璃化冷凍技術(shù)目前已被證實較慢速冷凍對于卵母細胞凍存有更高的效率，但是冷凍保護劑所需

3、的高濃度可能給細胞帶來毒性，冷凍成功的關(guān)鍵在于足夠高的降溫速率和不至于給細胞造成毒性的冷凍保護劑濃度。
　　本研究通過觀察人卵母細胞玻璃化冷凍-復(fù)蘇前后的形態(tài)測量指標(biāo)、透明帶的消化時間、ROS水平、紡錘體結(jié)構(gòu)與H1FOO表達變化研究玻璃化冷凍-復(fù)蘇過程對卵母細胞在形態(tài)學(xué)、細胞學(xué)和分子學(xué)水平的影響，進而比較新鮮和凍融后人體外成熟的卵母細胞體外受精和胚胎發(fā)育潛能，并對凍融卵母細胞發(fā)育的囊胚進行基因組的測序（CNV-seq）以驗證該技術(shù)

4、在基因組水平的穩(wěn)定性和安全性，最后我們進一步分析玻璃化冷凍技術(shù)應(yīng)用于臨床人卵母細胞冷凍的數(shù)據(jù)，并對出生子代家庭進行微陣列芯片比較基因組雜交（a-CGH）檢測，以期對人卵母細胞玻璃化凍存的安全性和效率有多方面、深入研究，為該技術(shù)的完善和臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
　　第一部分：玻璃化冷凍對卵母細胞的影響及機制研究
　　目的：探索玻璃化冷凍技術(shù)對人卵母細胞結(jié)構(gòu)和功能的影響。方法：收集常規(guī)體外受精周期中人未受精卵母細胞，在玻璃化冷凍前

5、后分別測量其形態(tài)學(xué)指標(biāo)，包括平均直徑、卵周隙大小、透明帶厚度和記錄極體完整情況，比較冷凍前后的形態(tài)學(xué)指標(biāo)的變化；將未受精卵母細胞分為新鮮組和冷凍組，比較兩組透明帶用臺式液消化所需的時間、胞漿ROS水平和H1FOO表達強度，收集常規(guī)體外受精周期獲得的未成熟卵母細胞成熟培養(yǎng)后得到成熟卵母細胞，用紡錘體觀測儀觀察卵母細胞紡錘體，按紡錘體影像分為A、B、C三類，比較冷凍前后紡錘體形態(tài)變化，并進一步對部分冷凍后的卵母細胞進行紡錘體的熒光免疫染色，

6、激光共聚焦顯微鏡觀察其結(jié)構(gòu)。結(jié)果：（1）共測量未受精MII卵母細胞236枚，玻璃化冷凍-復(fù)蘇后存活201枚，復(fù)蘇率85.17%（201/236），復(fù)蘇后0小時卵母細胞直徑（OD）和透明帶間隙（PS）均有顯著性差異（P<0.05）,透明帶厚度（ZP）和第一極體完整率沒有明顯差異，復(fù)蘇后2小時所有卵母細胞形態(tài)學(xué)測量數(shù)據(jù)和冷凍前均沒有明顯差異。（2）共消化冷凍前卵母細胞50枚，冷凍復(fù)蘇2小時后卵母細胞50枚，冷凍復(fù)蘇后的卵母細胞透明帶消化時間

7、顯著高于未冷凍卵母細胞（P<0.05）。（3）卵母細胞ROS水平共檢測未受精卵188枚，其中未冷凍卵母細胞42枚，冷凍復(fù)蘇后0h卵母細胞49枚，與冷凍前卵母細胞相比ROS水平明顯降低，冷凍復(fù)蘇后2h卵母細胞51枚，ROS水平明顯高于冷凍前卵母細胞，冷凍復(fù)蘇后4h卵母細胞46枚，與冷凍前卵母細胞相比ROS水平略高，但統(tǒng)計學(xué)上沒有明顯差異。（4）H1FOO表達檢測共檢測未受精卵母細胞104枚，均檢測到H1FOO表達，其中冷凍前卵母細胞50枚

8、，冷凍復(fù)蘇后2h卵母細胞54枚，冷凍后卵母細胞的H1FOO表達較冷凍前表達明顯減弱（P<0.05）。（5）共用紡錘體觀測儀觀察IVM后獲得的MII期卵母細胞230枚，玻璃化冷凍復(fù)蘇后共有195枚卵母細胞存活，不同紡錘體類型的卵母細胞復(fù)蘇率有顯著差異（P<0.05），冷凍前后A類卵母細胞所占比例無明顯差異。（6）共檢測IVM后的新鮮MII卵母細胞16枚，異常紡錘體2枚，冷凍復(fù)蘇后卵母細胞30枚，異常4枚，異常率占13.3%（4/30），玻

9、璃化冷凍對紡錘體結(jié)構(gòu)無影響。結(jié)論：玻璃化冷凍技術(shù)對卵母細胞的透明帶、復(fù)蘇后2hROS水平和H1FOO表達均有影響，對復(fù)蘇后2h卵母細胞形態(tài)學(xué)指標(biāo)和紡錘體無影響。
　　第二部分：玻璃化冷凍后卵母細胞發(fā)育潛能與囊胚CNV-seq測序
　　目的：比較人卵母細胞冷凍前后卵母細胞發(fā)育潛能，在基因組水平對冷凍-復(fù)蘇卵母細胞發(fā)育的囊胚進行安全性檢測。方法：收集常規(guī)體外受精周期中未成熟卵母細胞，進行體外成熟培養(yǎng)后獲得成熟卵母細胞，隨機分為新

10、鮮組和冷凍組，進行卵母細胞漿內(nèi)單精子注射授精和胚胎培養(yǎng)，比較兩組卵母細胞受精率、卵裂率和胚胎發(fā)育情況。并對冷凍組獲得的囊胚進行基因組測序（CNV-SEQ），同時我們對未冷凍卵母細胞發(fā)育的囊胚進行CNV-SEQ測序作為參照。結(jié)果：共獲得IVM后MII卵母細胞313枚，其中106枚未經(jīng)過玻璃化冷凍-復(fù)蘇程序直接進行卵母細胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）授精與胚胎培養(yǎng)，207枚進行玻璃化冷凍復(fù)蘇，存活175枚，存活率84.54%，兩組受精率卵裂率

11、均沒有統(tǒng)計學(xué)差異，胚胎可
　　用率和囊胚獲得率冷凍組明顯低于新鮮組（P<0.05），D3胚胎中卵裂球多于5細胞的胚胎數(shù)目冷凍組明顯少于新鮮組（P<0.05），而兩組碎片≥50%的胚胎所占比率無差異。對冷凍組獲得的囊胚CNV-SEQ結(jié)果顯示：8枚檢測成功的囊胚中只有1枚胚胎為異常胚胎，異常率12.5%。而對未冷凍卵母細胞受精后發(fā)育的囊胚，5枚檢測成功的囊胚中有2枚異常，異常率為40%。結(jié)論：玻璃化冷凍技術(shù)不影響卵母細胞的受精能力，但

12、是影響胚胎的發(fā)育潛能，表現(xiàn)在發(fā)育速度減慢。對于發(fā)育到囊胚的胚胎，基因測序的結(jié)果表明在基因組層面是穩(wěn)定安全的。
　　第三部分：玻璃化凍存卵母細胞的臨床應(yīng)用及子代安全性的研究
　　目的：研究統(tǒng)計玻璃化冷凍-復(fù)蘇技術(shù)在臨床實施的數(shù)據(jù)，并在基因組水平檢測卵母細胞冷凍出生子代的安全性。方法：統(tǒng)計本中心2011至2013年間卵母細胞冷凍與復(fù)蘇周期臨床數(shù)據(jù)，并對出生卵母細胞冷凍子代的兩個家庭進行全血微陣列芯片比較基因組雜交（a-CGH）檢

13、測出生子代安全性。結(jié)果：共實施卵母細胞冷凍82周期，其中取卵日無精子可用55周期，部分卵母細胞凍存23周期，生育力保存4周期，共冷凍MII期卵母細胞623枚，平均每周期冷凍7.6枚。共實施玻璃化冷凍卵母細胞復(fù)蘇45周期，共復(fù)蘇卵母細胞338枚，存活率84.19%，受精率81.23%，卵裂率92.44%，D3胚胎可用率39.54%，共移植28周期，妊娠7周期，妊娠率25%。其中取卵日無精子可用組與部分凍存卵母細胞組比較，年齡明顯偏高（P<

14、0.05）,胚胎可用率明顯偏低（P<0.05），由于例數(shù)較小，妊娠率沒有統(tǒng)計學(xué)差異（19.05%vs.42.86%，P>0.05）?！?5歲組的每周期復(fù)蘇卵母細胞數(shù)與有可用胚胎周期的比率明顯高于大于35歲組，同樣由于例數(shù)較少，妊娠率沒有統(tǒng)計學(xué)上的差異（27.27%vs.16.67%）。對于兩個家庭的父母和子代a-CGH分析顯示，卵母細胞冷凍復(fù)蘇后出生的子代并未出現(xiàn)新的基因變異。結(jié)論：卵母細胞玻璃化冷凍保存對于取卵日無精子可用和獲卵數(shù)較多