實(shí)驗(yàn)性淋巴瘀滯家兔模型的建立及其對肝組織結(jié)構(gòu)的影響.pdf

1、目的:
　　 器官的正常淋巴回流或引流,對于維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定具有重要作用;了解器官的正常淋巴引流,以及淋巴回流障礙對器官組織結(jié)構(gòu)和物質(zhì)代謝的影響,具有重要的生理和病理意義。眾所周知,淋巴管道是一種單向引流管道系統(tǒng),主要從各器官或組織回收液體、脂肪和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì),并以淋巴的形式注入血液,還具有清除細(xì)胞碎屑和病原體的重要功能。約占全身半數(shù)以上的淋巴,來源于腹腔內(nèi)臟器官,尤其是小腸和肝臟。如果將胸導(dǎo)管結(jié)扎,運(yùn)送來自肝臟和

2、腸道的蛋白和脂類物質(zhì)被阻斷,是否嚴(yán)重影響蛋白和脂肪的運(yùn)輸以及物質(zhì)的代謝?是否能夠快速建立淋巴側(cè)支循環(huán)?目前,學(xué)術(shù)界對此問題尚未達(dá)到統(tǒng)一認(rèn)識。鑒于存在不同的觀點(diǎn),本實(shí)驗(yàn)擬通過對正常家兔和結(jié)扎胸導(dǎo)管模型動物肝組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的形態(tài)學(xué)觀察,為探討實(shí)驗(yàn)性淋巴瘀滯誘發(fā)肝組織結(jié)構(gòu)變化,提供形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　 方法:
　　 1.實(shí)驗(yàn)動物與取材
　　 選用5月齡家兔20只,體重2.5～3.0 kg,雌雄不拘,隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)(手術(shù)1

3、5只)組和對照(假手術(shù)5只)組;實(shí)驗(yàn)前2～3個(gè)小時(shí)喂食脂類食物,6％水合氯醛(5ml/kg)耳緣靜脈注射麻醉下,于腹部行胸導(dǎo)管結(jié)扎術(shù)。術(shù)后的實(shí)驗(yàn)動物,常規(guī)喂養(yǎng),三個(gè)月、六個(gè)月分批取材,用于光鏡和電鏡組織樣品的制備。
　　 2.光鏡樣品制備與觀察
　　 肝臟石蠟包埋組織切片,行常規(guī)HE染色和光鏡觀察;冰凍組織切片,行5'-核苷酸酶和堿性磷酸酶(5'-Nase-alpase)組織化學(xué)雙重染色和光鏡觀察;以顯示肝臟細(xì)微結(jié)構(gòu)以及

4、肝內(nèi)脈管系統(tǒng)的分布特點(diǎn)。
　　 3.掃描電鏡樣品制備與觀察
　　 經(jīng)5'-Nase-ALPase酶組織化學(xué)雙重染色的肝組織標(biāo)本,徹底干燥后不需金屬噴鍍,利用掃描電子顯微鏡,觀察二次電子圖像和背散射電子圖像,以顯示肝組織內(nèi)血管和淋巴管的分布特點(diǎn)。
　　 4.免疫組織化學(xué)染色與光鏡觀察
　　 對照和實(shí)驗(yàn)組家兔肝組織冰凍切片,行瘦素免疫組織化學(xué)染色,光鏡觀察瘦素及其受體,在肝組織內(nèi)各類細(xì)胞上的免疫反應(yīng)陽性表達(dá)。

5、
　　 5.透射電鏡樣品制備與觀察
　　 肝組織標(biāo)本行常規(guī)透射電鏡樣品制備,肝組織超薄切片,進(jìn)行透射電鏡觀察;以揭示家兔肝組織的超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn),以及實(shí)驗(yàn)性淋巴瘀滯對肝臟組織超微結(jié)構(gòu)的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.石蠟包埋組織切片HE染色光鏡觀察顯示,對照組家兔肝組織結(jié)構(gòu)清晰,肝小葉中央有一條延其長軸走行的中央靜脈,肝細(xì)胞索和肝血竇以中央靜脈為中心,向周圍呈放射狀排列。在匯管區(qū)或門管區(qū),明顯可見三類伴行的管

6、道,即小葉間靜脈、小葉間動脈和小葉間膽管;但是,淋巴管與組織間隙不易區(qū)分。實(shí)驗(yàn)組家兔肝組織的正常結(jié)構(gòu)被破壞,大量肝細(xì)胞,尤其是近中央靜脈的肝細(xì)胞,出現(xiàn)明顯的脂質(zhì)沉積或空泡樣變;匯管區(qū)脂變不明顯;肝小葉內(nèi)脂質(zhì)沉積,大量肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞,部分肝血竇消失,出現(xiàn)局部壞死,炎癥細(xì)胞浸潤。
　　 2.冰凍切片酶組織化學(xué)雙重染色光鏡觀察顯示,家兔肝組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與HE染色切片相似;肝組織內(nèi)淋巴管呈現(xiàn)棕褐色5'-核苷酸酶陽性反應(yīng),但是,只見于肝組

7、織間質(zhì)或匯管區(qū)內(nèi)。毛細(xì)血管和小血管普遍呈現(xiàn)藍(lán)染,為堿性磷酸酶陽性反應(yīng);較大的血管和小葉間膽管,也普遍呈現(xiàn)棕褐色5'-核苷酸酶陽性反應(yīng)。
　　 3.酶染切片掃描電鏡觀察顯示,在5'Nase-Alpase雙重染色的肝組織切片上,由于管壁具有大量鉛金屬反應(yīng)產(chǎn)物的沉積,匯管區(qū)內(nèi)小葉間動脈、靜脈、膽管及其淋巴管,普遍呈現(xiàn)明亮的背散射電子圖像;可能是由于這些管道性結(jié)構(gòu),均含有豐富的5'-核苷酸酶。
　　 4.冰凍切片免疫組織化學(xué)染色

8、光鏡觀察顯示,對照組家兔肝組織的瘦素免疫陽性反應(yīng),主要位于肝細(xì)胞膜、脂肪細(xì)胞膜、貯脂細(xì)胞膜及其胞質(zhì)。在實(shí)驗(yàn)組動物的肝組織,瘦素免疫陽性細(xì)胞與對照組相似,但是,免疫陽性反應(yīng)明顯增強(qiáng);尤其是那些具有大量脂質(zhì)沉積的肝細(xì)胞,普遍呈現(xiàn)瘦素免疫反應(yīng)強(qiáng)陽性。
　　 5.超薄組織切片透射電鏡觀察顯示,對照組家兔肝組織上,可見肝細(xì)胞排列緊密,細(xì)胞膜凹陷形成膽小管,細(xì)胞內(nèi)各類細(xì)胞器較豐富,不同形態(tài)和大小的分泌顆粒清晰可辨;此外,還可觀察到肝血竇內(nèi)皮

9、細(xì)胞、庫否細(xì)胞、貯脂細(xì)胞及其超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。然而在實(shí)驗(yàn)組家兔肝組織,肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化最明顯,表現(xiàn)為線粒體腫脹,大量脂滴的沉積,細(xì)胞膜電子密度減低;儲脂細(xì)胞周圍大量脂質(zhì)物質(zhì)沉積,膠原原纖維增生;肝組織間質(zhì)增寬,結(jié)締組織增生,間質(zhì)內(nèi)大量脂質(zhì)物質(zhì)的堆積,甚至形成膠原原纖維樣團(tuán)塊結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)論:
　　 1.肝的淋巴主要通過胸導(dǎo)管來回流,腹部手術(shù)結(jié)扎家兔的胸導(dǎo)管,可成功建立肝淋巴瘀滯的實(shí)驗(yàn)動物模型;
　　 2.實(shí)驗(yàn)性肝淋巴