通過調(diào)節(jié)線粒體形態(tài)提高光動力治療腫瘤效果的基礎研究.pdf

1、腫瘤是威脅人類健康的重大疾病之一,發(fā)病率及死亡率逐年提高。手術、放療與化療仍是治療腫瘤的三種常規(guī)手段,但這些治療手段常難以獲得理想效果,為了提高對腫瘤的治療效果,人們不斷探索治療腫瘤的新方法。光動力療法(Photodynamic therapy,PDT)是一種精確靶向治療腫瘤的方法,它因具有選擇性高、效果顯著、對正常組織傷害小及無全身毒副作用等優(yōu)點,在臨床應用中取得了良好的成就。
　　光動力療法是一種利用光敏劑在腫瘤內(nèi)有選擇性吸收

2、和潴留的特性,然后用光敏劑的特定吸收波長的光照射,在氧分子的參與下,腫瘤組織內(nèi)產(chǎn)生活性氧物質(zhì)(Reactive Oxygen Species,ROS),這些活性氧物質(zhì)會引起蛋白質(zhì)、脂類、核酸和其它細胞組分的損傷,從而引起腫瘤細胞的凋亡或壞死,最終實現(xiàn)治療腫瘤的目的。PDT對腫瘤細胞的殺傷效率受多種因素的影響:光敏劑的種類,激光的波長,細胞類型等。在以上同等條件下,光敏劑的亞細胞定位則成為了影響PDT效率的關鍵因素,因為它決定光動力損傷的

3、最初位點。很多研究證實線粒體是光動力治療的重要靶點,且定位在線粒體的光敏劑比定位在其它細胞器的光敏劑能更有效地殺死腫瘤細胞。光照后起始反應是在線粒體上形成單態(tài)氧,接著線粒體上的活性氧誘導線粒體通透性改變進而導致線粒體去極化,變形,細胞色素c的釋放,最終導致細胞凋亡。線粒體是一種高度動態(tài)變化的細胞器,它的形態(tài)在片段化和管狀化之間不停轉(zhuǎn)換,本文擬通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞線粒體形態(tài)以提高腫瘤細胞對PDT的敏感性從而達到提高光動力治療腫瘤效果的目的。<

4、br>　　1.本研究用相同劑量的PDT處理線粒體形態(tài)不同的HeLa細胞發(fā)現(xiàn):片段化線粒體膜電位的下降速度高于管狀化線粒體;用相同濃度的H2O2孵育含有不同形態(tài)線粒體的腫瘤細胞后觀察到了相同的結(jié)果。由此可知,腫瘤細胞內(nèi)的片段化線粒體比管狀化線粒體抗氧化能力弱。2.通過轉(zhuǎn)染Drp1質(zhì)粒和Mfn2質(zhì)粒,把HeLa細胞內(nèi)線粒體分別調(diào)節(jié)成片段化和管狀化,然后用相同劑量的PDT處理兩組細胞,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染Drp1質(zhì)粒組(以片段化線粒體為主)的細胞死亡

5、率顯著高于轉(zhuǎn)染Mfn2質(zhì)粒組(以管狀化線粒體為主)。表明含有片段化線粒體的腫瘤細胞比含有管狀化線粒體的腫瘤細胞對PDT更敏感。3.為了研究線粒體形態(tài)的變化與細胞周期的關系,本研究采用血清饑餓和化療藥物聯(lián)合的方法使細胞周期同步化,并用激光共聚焦顯微鏡觀察和統(tǒng)計各周期細胞不同形態(tài)線粒體所占的比例,結(jié)果顯示:線粒體形態(tài)隨著細胞周期進程而規(guī)律性變化,S期管狀化線粒體最多,M期片段化線粒體最多。然后用相同劑量的PDT處理各周期細胞,發(fā)現(xiàn)細胞死亡率

6、與片段化線粒體的比例呈正相關,M期最高,S期最低。4.為了驗證能否把實體瘤內(nèi)細胞調(diào)控在線粒體片段化程度高的M期以提高腫瘤靶向PDT治療的療效,本研究建立了裸鼠腫瘤模型,待小鼠腫瘤直徑7-9mm時,設立對照組、紫杉醇組和5-氟尿嘧啶組,尾靜脈注射藥物一定時間后取腫瘤組織剪碎消化成細胞懸液,用流式細胞儀檢測各周期細胞的比例,結(jié)果顯示紫杉醇能顯著增加腫瘤組織內(nèi)M期的細胞比例,5-氟尿嘧啶顯著增加腫瘤組織內(nèi)S期的細胞比例。取以上三組腫瘤組織做超

7、薄切片用透射電子顯微鏡觀察線粒體的形態(tài),測量并統(tǒng)計線粒體的長度。結(jié)果顯示對照組線粒體呈短棒狀和圓球狀,5-氟尿嘧啶組線粒體主要呈現(xiàn)出短棒狀,紫杉醇組線粒體主要呈現(xiàn)出圓球狀。三組線粒體的平均長度分別為487nm,791nm和295nm。免疫組化的結(jié)果顯示各種處理中,紫杉醇聯(lián)合PDT處理組凋亡蛋白的釋放量最多。通過對各組腫瘤生長速率的統(tǒng)計,結(jié)果顯示,單獨使用兩種化療藥物都不能顯著抑制小鼠腫瘤生長,低劑量的紫杉醇能顯著地增加PDT的治療效果,

8、而5-氟尿嘧啶聯(lián)合PDT組與單純PDT組比較則沒有顯著性差異。
　　綜上所述:本課題通過對腫瘤細胞內(nèi)不同形態(tài)線粒體抗氧化能力的研究,首次提出:1.線粒體形態(tài)差異是不同周期腫瘤細胞對PDT敏感性不同的原因之一;2.從調(diào)控腫瘤細胞線粒體形態(tài)變化的角度選擇化療藥物以提高腫瘤細胞對PDT的敏感性,提高PDT的療效實現(xiàn)化療藥物與腫瘤靶向PDT協(xié)同抗腫瘤的效應。本工作不僅對揭示PDT殺傷腫瘤細胞的機制有所貢獻,也為臨床優(yōu)化PDT與化療藥物聯(lián)合