脂筏在fMLP誘導(dǎo)的人中性粒細(xì)胞極性化過(guò)程中作用的研究.pdf

1、研究背景: 中性粒細(xì)胞（Polymorphonuclear nertrophils）是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分。中性粒細(xì)胞在宿主抵抗細(xì)菌和真菌感染中起著重要的作用，他們的主要功能是在機(jī)體發(fā)生炎癥時(shí)，通過(guò)外滲出血管壁并遷移到炎癥位置，通過(guò)吞噬作用和釋放超氧化物和/或蛋白水解酶殺死細(xì)菌和入侵的微生物。一旦感知到趨化物質(zhì)的存在，中性粒細(xì)胞前極形成一個(gè)富含絲狀肌動(dòng)蛋白的片狀偽足，后極形成富含肌球蛋白的尾足。雖然中性粒細(xì)胞在生理功能中發(fā)揮重要作

2、用，但如果遷移和外滲的機(jī)制和任何信號(hào)分子調(diào)控失敗，都會(huì)導(dǎo)致中性粒細(xì)胞的異常激活。臨床上一些疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、敗血癥、缺血/再灌注損傷、病毒性心肌炎、動(dòng)脈粥樣硬化、過(guò)敏反應(yīng)、炎癥性皮膚病甚至腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移都和中性粒細(xì)胞極性功能有關(guān)。因而研究中性粒細(xì)胞極性機(jī)制，對(duì)防止中性粒細(xì)胞異常激活導(dǎo)致的各種疾病和組織損傷具有重要意義。
　　 在極性研究的過(guò)程中，脂筏作為信號(hào)分子組織者是近些年的研究熱點(diǎn)。脂筏就像一個(gè)蛋白質(zhì)分子?？康钠?/p>

3、臺(tái)，在受到外源趨化物的誘導(dǎo)下，它組裝大量的信號(hào)分子，與膜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)分選等保持高度密切的關(guān)系。脂筏上的膽固醇能夠被甲基-β-環(huán)糊精（mβCD）包裹，從而破壞脂筏的結(jié)構(gòu)。在研究中使用mβCD包裹膽固醇后破壞脂筏結(jié)構(gòu)完整性，抑制了細(xì)胞的皺褶形成，使用CLM可以可逆性修復(fù)脂筏結(jié)構(gòu)的完整性，這表明脂筏在中性粒細(xì)胞極性化過(guò)程中有著很重要的作用。
　　 近年來(lái)，細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度（Ca2+）變化被認(rèn)為參與中性粒細(xì)胞多種功能調(diào)節(jié)，如極性（

4、趨化）和遷移、活性氧的產(chǎn)生。胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度升高依賴于兩種途徑:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)釋放和細(xì)胞膜外鈣內(nèi)流。胞外鈣內(nèi)流主要由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)清空引起質(zhì)膜上的鈣通道開(kāi)放導(dǎo)致外鈣內(nèi)流，就是所謂的鈣庫(kù)操縱的鈣內(nèi)流機(jī)制(SOCE)。脂筏作為SOCE的信號(hào)平臺(tái)對(duì)于中性粒細(xì)胞極性化有著重要的作用，因而探討中性粒細(xì)胞極性化過(guò)程中膜電流的特性就顯得尤其重要，可以為研究中性粒細(xì)胞極性化提供電生理理論依據(jù)。
　　 另有研究表明Rho小G蛋白參與極性形成、細(xì)胞的遷移

5、、腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移等。尤其是Rac1，Rac2通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架而參與細(xì)胞極性和趨化的調(diào)節(jié)機(jī)制已經(jīng)有很多文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)。Rho家族小G蛋白在中性粒細(xì)胞中參與細(xì)胞骨架重組，這些蛋白通過(guò)失活(GDP-bound)和激活(GTP-bound)兩種狀態(tài)的循環(huán)來(lái)控制一些生理過(guò)程，他們的活性是由鳥(niǎo)嘌呤核苷分解抑制因子(guanosine dissociationinhibitors)，GTPase活化蛋白（GTPase activating protei

6、ns）和鳥(niǎo)嘌呤核苷交換因子(guanosine exchange factors，GEF)來(lái)調(diào)節(jié)。
　　 因此，深入闡明脂筏在fMLP所誘導(dǎo)的人中性粒細(xì)胞極性化的影響過(guò)程中的作用，為防止和治療中性粒細(xì)胞異常激活提供新的方向。
　　 目的:本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究脂筏對(duì)fMLP所誘導(dǎo)的人中性粒細(xì)胞極性的影響，探討脂筏在人中性粒細(xì)胞極性中的調(diào)控機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.采用Dextran方法讓紅細(xì)胞自然沉降，運(yùn)用

7、經(jīng)典密度梯度離心，低滲裂解紅細(xì)胞后急性分離人外周血中性粒細(xì)胞。獲得的中性粒細(xì)胞進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色，分析細(xì)胞活性，細(xì)胞的活度大于98％。
　　 2.用Zigmond chamber觀察中性粒細(xì)胞的極性化率。
　　 3.Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)中性粒細(xì)胞的定向遷移能力的變化。
　　 4.運(yùn)用膜片鉗相關(guān)儀器檢測(cè)電極電阻并對(duì)中性粒細(xì)胞進(jìn)行封接和破膜，記錄膜電容和各種處理因素膜電流的變化。
　　 5.使用鈣離子敏

8、感性指示劑Fluo-4/AM預(yù)處理細(xì)胞后，在激光共聚焦顯微鏡下監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的變化情況。
　　 6.應(yīng)用GST-pull down and Western blotting方法檢測(cè)活性Rac1，Rac2蛋白的表達(dá)。
　　 7.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±SD)表示，數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0軟件處理分析。三組及三組以上樣本均數(shù)比較滿足方差齊性用One-way ANOVA方差分析，組間兩兩比較采用LSD法;若方差不齊，采

9、用welch檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用Durnett's T3法。P＜0.05為存在顯著性差異。
　　 結(jié)果:
　　 1.fMLP可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生SOCE，并使膜電位增加。
　　 2.mβCD和CLM均能引起中性粒細(xì)胞膜電流的變化，與對(duì)照組或/和fMLP組比較，電流密度變化均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。mβCD破壞脂筏結(jié)夠完整性后抑制了fMLP誘導(dǎo)的細(xì)胞外鈣內(nèi)流，CLM可逆性恢復(fù)脂筏結(jié)構(gòu)后細(xì)胞外鈣內(nèi)流增加。

10、r>　　 3.Zigmond chamber實(shí)驗(yàn)顯示mβCD破壞細(xì)胞脂筏結(jié)構(gòu)完整性后極性化率下降，CLM可逆性恢復(fù)脂筏結(jié)構(gòu)完整性后極性化率上升。
　　 4.Transwell小室檢測(cè)中性粒細(xì)胞的遷移能力的變化實(shí)驗(yàn)中，mβCD破壞細(xì)胞脂筏結(jié)構(gòu)完整性后定向遷移能力顯著性下降，CLM恢復(fù)細(xì)胞脂筏結(jié)構(gòu)完整性后中性粒細(xì)胞定向遷移能力與mβCD組相比顯著性增加。
　　 5.免疫印跡結(jié)果顯示fMLP刺激組顯示活化的Rac2、Rac1

11、的蛋白條帶最濃，當(dāng)脂筏結(jié)構(gòu)完整性用mβCD破壞后再進(jìn)行fMLP刺激，則細(xì)胞內(nèi)活化的Rac2、Rac1的蛋白條帶都比f(wàn)MLP刺激組弱。而用CLM恢復(fù)細(xì)胞脂筏結(jié)構(gòu)后則細(xì)胞內(nèi)活化的Rac2、Rac1的蛋白條帶比mβCD組強(qiáng)但比f(wàn)MLP刺激組弱。
　　 結(jié)論:
　　 1.fMLP可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞膜電流發(fā)生改變，這種改變可能參與介導(dǎo)SOCE的變化。
　　 2.破壞脂筏結(jié)構(gòu)完整性的藥物(mβCD)能降低fMLP誘導(dǎo)極性細(xì)胞的