線粒體和ASC在中性粒細(xì)胞非凋亡性程序化細(xì)胞死亡機(jī)制中的作用.pdf

1、目的： (1)觀察線粒體(mitochondria)在前列腺素E2受體亞型3(EP3)選擇性激動劑ONO-AE-248誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞(polymorpho-nuclear neutrophils，PMN)非凋亡性程序化死亡(non-apoptotic progra-mmed cell death，non-apoptotic PCD)中的形態(tài)結(jié)構(gòu)及跨膜勢能(mitochondria transmembrane potential

2、s，△ψmt)的改變。 (2)前期研究利用雙向電泳(two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)和蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析(matrix-assisted laser desorption/ionization time of misht mass spectrometry，MALDI-TOF MS)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在PMN自發(fā)性凋亡和ONO-AE-248所誘發(fā)的非凋亡性程序化死亡中有差異表達(dá)的蛋白質(zhì)存在，

3、其中最為顯著的差異表達(dá)蛋白可能是凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)。 本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步設(shè)計(jì)編碼ASC蛋白的基因TMS1的特異性引物，利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)反應(yīng)(reversetranscriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR)技術(shù)檢測ASC在空白、LPS、TNF-a及ONO

4、-AE-248刺激下的表達(dá)情況，探索PMN的這種新型細(xì)胞死亡形式的發(fā)生機(jī)制，進(jìn)而為在白細(xì)胞生物學(xué)界最終確立一種新型的PMN死亡形式-PMN非凋亡性程序化死亡奠定基礎(chǔ)。 方法：Ficoll法新鮮分離、純化健康志愿者外周血PMN，利用臺盼藍(lán)拒染試驗(yàn)、懷特-姬姆薩染色法鑒定細(xì)胞活力與純度(二者均應(yīng)大于96％方可用于后續(xù)試驗(yàn))。用RPMI-1640(含100 mL/L FCS)將分離純化的中性粒細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2×10

5、6個(gè)/mL，以每孔1 mL將細(xì)胞置于24孔板中。構(gòu)建四種PMN死亡模型(自發(fā)性凋亡組、LPS誘導(dǎo)的凋亡延遲組、TNF-a誘導(dǎo)的凋亡促進(jìn)組和ONO-AE-248誘發(fā)的非凋亡性程序化死亡組)，在37℃(含5％CO2，濕度90％)的恒溫孵箱中培養(yǎng)到預(yù)定時(shí)間后，經(jīng)20g/L戊二醛10g/L的鋨酸固定、丙酮梯度脫水、環(huán)氧樹脂包埋聚合、超薄切片和醋酸鈾染色后，運(yùn)用透射電鏡(transmission electron microscopy,TEM)觀

6、察2h、6h的PMN內(nèi)線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化；利用Mitocapture染液結(jié)合線粒體后隨膜勢能的改變激發(fā)出不同熒光的特點(diǎn)，用流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)檢測不同細(xì)胞死亡模型中3h、6h、9h和18 h線粒體跨膜勢能的改變；Trizol法提取PMN內(nèi)總RNA，運(yùn)用紫外分光光度法和RNA瓊脂糖電泳法鑒定其純度和含量(OD260/OD280之比值應(yīng)在1.8～2.0。瓊脂糖電泳出現(xiàn)明顯的28s，18s和5s三條條帶，且28

7、s條帶亮度約為18的2倍)。按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序的要求將20μL體系中的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按PCR試劑盒和引物退火溫度的要求在50μL體系進(jìn)行聚合酶聯(lián)反應(yīng)，然后用1.5％進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析ASC在四種不同死亡模型中表達(dá)的情況。 結(jié)果： (1)ONO-AE-248刺激6h后PMN線粒體多腫脹顯著，體積增大，基質(zhì)變淡，嵴紊亂，嵴斷裂，甚至空泡變，明顯不同于自發(fā)性凋亡組； (2)在PMN體外培養(yǎng)早期3

8、h、6h和9h，ONO-AE-248即能迅速導(dǎo)致PMN線粒體膜勢能的潰散，其強(qiáng)度遠(yuǎn)大于自發(fā)性凋亡組(P<0.05)，18h后線粒體膜勢能降至低值； (3)通過RT-PCR檢測四種PMN細(xì)胞死亡模型發(fā)現(xiàn)，ASC mRNA在自發(fā)性凋亡組、凋亡促進(jìn)組和凋亡延遲組均有較強(qiáng)的表達(dá)，但在ONO-AE-248刺激組表達(dá)卻很弱(P<0.01)。 結(jié)論： (1)線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的劇烈變化是ONO-AE-248誘導(dǎo)的PMN非凋亡性程序

9、化死亡區(qū)別于凋亡的早期形態(tài)學(xué)特征事件之一，早期線粒體外膜通透性(mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP)劇變并導(dǎo)致PMN迅速突破線粒體膜勢能屏障可能是ONO-AE-248發(fā)揮強(qiáng)大的致非凋亡性程序化細(xì)胞死亡效應(yīng)的分子機(jī)制之一。 (2)ONO-AE-248誘發(fā)的PMN非凋亡性程序化死亡組與PMN自發(fā)性凋亡組相比較凋亡相關(guān)的斑點(diǎn)樣蛋白 ASC 的表達(dá)存在明顯的差異，ASC在

10、ONO-AE-248所誘導(dǎo)的PMN非凋亡性程序化死亡組中的表達(dá)量極低，而在自發(fā)性凋亡組、LPS誘導(dǎo)的PMN凋亡延遲組和TNF-a誘導(dǎo)的凋亡促進(jìn)組中的表達(dá)較高。表明：ASC在PMN凋亡的進(jìn)程中可能發(fā)揮強(qiáng)大的正調(diào)控作用，即當(dāng)PMN高表達(dá)ASC時(shí)，促使細(xì)胞內(nèi)生化信號循傳統(tǒng)凋亡的途徑發(fā)展；而當(dāng)ONO-AE-248抑制ASC表達(dá)時(shí)，可能就關(guān)閉了傳統(tǒng)凋亡的信號途徑，但同時(shí)也解除了對非凋亡性細(xì)胞程序化死亡信號途徑的阻遏，從而激活相關(guān)的致死信號蛋白，使