CDK2-AP1改變與微衛(wèi)星不穩(wěn)定結(jié)直腸癌發(fā)生關(guān)系的研究.pdf

1、我國是世界上新發(fā)癌癥患者最多的國家,惡性腫瘤是主要死因之一,估計每年約有130萬人死于惡性腫瘤。而結(jié)直腸癌居腫瘤發(fā)病和癌癥死因第三、四位,而且呈現(xiàn)發(fā)病率不斷攀升和發(fā)病低齡化的特點。近二十年來,隨著我國居民生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變,結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)上升的趨勢。因此對結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)發(fā)病機制以及防治策略進行研究有十分重要的意義。微衛(wèi)星序列是廣泛存在于原核及真核生物基因組中具有高度多態(tài)性的短的

2、串聯(lián)重復(fù)核苷酸序列,由1～6個核苷酸組成,重復(fù)次數(shù)可達10～50次。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability,MSI)是指DNA復(fù)制時,由于復(fù)制錯誤且不能被錯配修復(fù)酶更正而引起的簡單重復(fù)序列的改變。就腫瘤而言,指的是與正常組織相比,在腫瘤中某一微衛(wèi)星由于重復(fù)單位的插入或缺失而造成的微衛(wèi)星長度的任何改變,出現(xiàn)新的微衛(wèi)星等位基因現(xiàn)象。MSI現(xiàn)象最早在結(jié)直腸癌中發(fā)現(xiàn),目前為止,CRC也是MSI研究最多的一種疾病。細(xì)

3、胞周期素依賴激酶2-相關(guān)蛋白1(cyclin-dependent kinase2-associatedprotein1,CDK2-AP1)是個定位于12q24的高度保守的基因,通過抑制細(xì)胞周期素依賴激酶2的活性發(fā)揮其生長抑制因子的作用。CDK2-AP1以雜合性丟失和其翻譯產(chǎn)物表達減少為特點,在正常組織中持續(xù)表達并且與多種細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因素相關(guān)。該基因的表達缺失見諸多種人類腫瘤,并且與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移、預(yù)后不良相關(guān)。Yuan等通過cDNA芯

4、片發(fā)現(xiàn),高頻微衛(wèi)星不穩(wěn)定(high-frequency MSI,MSI-H)結(jié)腸癌細(xì)胞系CDK2-AP1表達較微衛(wèi)星穩(wěn)定(microsatellite stable,MSS)細(xì)胞系下降,并且出現(xiàn)增殖活性增高、凋亡減少等生物學(xué)行為改變。MSI-H結(jié)腸癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)染CDK2-AP1后,上述表型可以得到逆轉(zhuǎn)。進一步研究發(fā)現(xiàn),CDK2-AP1基因3’-UTR區(qū)一個新的微衛(wèi)星位點(T)8改變見于21％(3／14)MSI-H結(jié)腸癌細(xì)胞系及13％(4／

5、31)的MSI結(jié)直腸癌腫瘤組織中,與CDK2-AP1基因表達下調(diào)相關(guān)。CDK2-AP1基因(T)8位點很可能是一個MSI-H結(jié)直腸腫瘤相關(guān)的新的重要單核苷酸微衛(wèi)星位點。
　　 本研究通過檢測CDK2-AP1基因微衛(wèi)星(T)8位點突變在中國浙江漢族人群結(jié)直腸癌患者中的分布情況,明確該位點的改變對CDK2-AP1基因表達的影響。通過研究,我們旨在建立惡性腫瘤MSI及基因突變檢測平臺,為構(gòu)建中國人特異性基因突變譜、研發(fā)中國漢族人特異性

6、基因治療策略及預(yù)后評估等奠定基因組基礎(chǔ)。在實驗過程中,我們首先對傳統(tǒng)的DNA酚-氯仿抽提法進行了改進,成功從福爾馬林固定后的結(jié)直腸癌患者的腫瘤和正常組織中分別抽提得到能夠滿足繼續(xù)實驗要求的DNA樣本,建立實驗室結(jié)直腸癌患者組織庫。在下一步的MSI-H結(jié)直腸癌患者的篩選過程中,我們引入具有高通量及高敏感性的多重?zé)晒釶CR-毛細(xì)管電泳法(flurescent multiplex polymerase chain reaction-capil

7、lary electrophoresis,FM—CE)檢測國際癌癥會議推薦的BAT25、BAT26、D2S123、D5S346和D17S250共5個微衛(wèi)星位點在總共506例結(jié)直腸癌腫瘤組織中的微衛(wèi)星狀態(tài),獲取MSI-H結(jié)直腸癌(有2個或2個以上位點存在微衛(wèi)星不穩(wěn)定現(xiàn)象)樣本共73例,約占總檢測樣本的14.43％,與文獻報道的頻率相符。同時我們通過熒光定量PCR的方法檢測了CDK2-AP1在結(jié)直腸癌細(xì)胞系RKO(MSI-H)和SW480(

8、MSS)中的表達情況,發(fā)現(xiàn)該基因在RKO細(xì)胞系中的表達較SW480細(xì)胞系顯著下調(diào)(P<0.05)。此外,我們還通過熒光定量PCR的方法檢測了CDK2-AP1在7例MSI-H結(jié)直腸癌患者和10例MSI-L／MSS結(jié)直腸癌患者組織中的表達情況,但并未發(fā)現(xiàn)兩者間的表達存在顯著的差異。
　　 本研究根據(jù)CDK2-AP1基因微衛(wèi)星(T)8位點的序列設(shè)計單標(biāo)的熒光引物,同樣采用熒光PCR-毛細(xì)管電泳法檢測73例MSI-H結(jié)直腸癌組織及60例

9、MSS／MSI-L(low—frequency MSI,MSI-L)結(jié)直腸癌組織中(T)8位點的突變情況,但是在檢測的133例組織中并未發(fā)現(xiàn)(T)8位點缺T突變的存在。而對其中20例組織的重復(fù)測序驗證也發(fā)現(xiàn)與熒光PCR-毛細(xì)管電泳法相同的結(jié)果。我們通過測序的方法檢測了包括RKO(MSI)、CW2(MSI)、Lovo(MSI)、SW480(MSS)、SW620(MSS)、HT29(MSS)和CaCo2(MSS)細(xì)胞系在內(nèi)7個CRC細(xì)胞系中

10、CDK2-AP1基因(T)8位點的改變情況。結(jié)果意外地在MSI CRC細(xì)胞系CW2中同時發(fā)現(xiàn)(T)7、(T)8和(T)9的存在,而在其他細(xì)胞系中并沒有發(fā)現(xiàn)(T)7的存在。另外,我們采用SPSS軟件分析了所有檢測樣本中已收集完全病理資料的170例樣本的微衛(wèi)星狀態(tài)與病人的年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤分期及分化級別這些臨床病理資料間的關(guān)系.結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSI-H病例與MSS／MSI-L病例相比,兩組患者間在年齡、性別

11、、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及分化級別之間并沒有顯示存在顯著差異；而相對MSS／MSI-L病例,MSI-H腫瘤好發(fā)于結(jié)腸(P=0.004<0.05),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；而在腫瘤的分期上,相對MSS／MSI-L病例,MSI-H腫瘤發(fā)現(xiàn)較早(P=0.047<0.5),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。通過上述研究,我們得出了以上結(jié)論：FM-CE法具有快速有效敏感性高的特點,適合于大樣本人群的微衛(wèi)星狀態(tài)篩選。在中國浙江漢族人群結(jié)直腸癌患者中并未發(fā)現(xiàn)在