應用熒光標記多重PCR對散發(fā)性結直腸癌進行微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測.pdf

1、結直腸癌是嚴重危害人類健康的常見惡性腫瘤之一。結直腸癌(Colorectalcarcinoma，CRC)從發(fā)生機制上可分為兩種不同的類型：染色體不穩(wěn)定和微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatelliteinstability，MSI)。MSI腫瘤的發(fā)生原因是DNA錯配修復(mismatchrepair，MMR)功能障礙，在復制重復DNA序列時常出現(xiàn)錯配修復失敗。顯然在DNA錯配修復缺陷的結直腸腫瘤中，微衛(wèi)星改變是一個重要的分子表型特征。MSI最

2、初在家族性非息肉性結直腸癌(HNPCC)腫瘤中得到確定，其原因是錯配修復基因的突變。典型的HNPCC患者90％以上為MSI瘤。也有15％左右的散發(fā)性結直腸癌存在微衛(wèi)星不穩(wěn)定。 微衛(wèi)星是重復單位為1-6bp的重復序列，數(shù)十萬個微衛(wèi)星位點遍及整個基因組。微衛(wèi)星是遺傳學圖譜制作、法醫(yī)個體鑒定、移植相容性檢測等的重要標記。MSI是指由于缺失或插入重復單位引起腫瘤DNA與同一個體的正常胚系DNA相比微衛(wèi)星長度發(fā)生改變，即產生異常長度的等位

3、基因。MSI作為MMR缺陷的指標，是由復制錯誤引起，相對于胚系長度而言微衛(wèi)星片段長度發(fā)生了縮短或延長。MSI的HNPCC發(fā)生的主要原因是生殖細胞的MMR基因突變。hMLH1,hMSH2，hMSH6和bPMS2等任何一個或幾個MMR基因的失活都能導致MSI發(fā)生。散發(fā)結直腸癌病人多數(shù)僅有MMR基因體細胞突變?，F(xiàn)在認為MSI的發(fā)生除了生殖細胞MMR基因的突變途徑以外，還與啟動子甲基化引起hMLH1表達缺失有關。 在散發(fā)性結直腸癌中hM

4、LH1啟動子甲基化是MSI的重要機制。但在散發(fā)性結直腸癌中MSI的發(fā)生機制還未被完全闡明，相關的基因、路徑等也可能與HNPCC不同。由于HNPCC和散發(fā)性結直腸癌的MSI發(fā)生機制上的差異，兩者的臨床意義也不同。MSI表型可分為兩類：高頻微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI-high，MSI-H)和低頻微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI-low，MSI-L)。 在散發(fā)性結直腸癌或在HNPCC中都能出現(xiàn)MSI-H。MSI-H的散發(fā)性結直腸癌大多數(shù)與表遺傳學因素引

5、起的MMR基因MLH1失活有關。與MSI-H腫瘤不同，MSI-L腫瘤與微衛(wèi)星穩(wěn)定(microsatellitestability，MSS)腫瘤相似，也通常是經(jīng)染色體不穩(wěn)定途徑發(fā)生的。因此提示MSI-L腫瘤與MSS腫瘤只是在微衛(wèi)星改變數(shù)量上不同，但沒有本質上的差異。 將來研究的一個方向是在非MSI-H腫瘤中評價特異性突變，力圖尋找并識別MSI-L腫瘤和MSS腫瘤的細微差異。MSI狀態(tài)可用于預測預后和指導治療方案制定。抑癌基因失活引

6、起的雜合性丟失(thelossofheterozygosity，LOH)是CRC發(fā)生的另一個重要過程。缺失突變或染色體丟失都可引起某一位點丟失一個等位基因而發(fā)生LOH。LOH作為另一個常見的微衛(wèi)星改變的表型，在CRC發(fā)生中具有重要意義，分析LOH是一種發(fā)現(xiàn)候選抑癌基因的有效途徑。 為了識別CRC典型的遺傳改變和尋找有用的標記物，我們對2007-2008年間的63例散發(fā)性結直腸癌與配對的正常粘膜上皮樣本進行了研究。通過評價CRC患

7、者的MSI頻率和LOH情況，研究它們在散發(fā)性結直腸癌中的作用。文獻報道采用不同類型和不同數(shù)量的標記檢測同一種腫瘤，得到的微衛(wèi)星頻率結果可截然不同，這很可能與所選標記及檢測方法的敏感度差異有關。 為了使微衛(wèi)星分析標準化，1997年美國國家癌癥學會會議推薦了5個微衛(wèi)星標記用于檢測MSI，以及根據(jù)檢測結果制定MSI分級指導方案。我們用多重熒光PCR結合ABI3130遺傳分析儀進行毛細管電泳(capillaryelectrophores

8、is，CE)，檢測并分析所推薦的5個微衛(wèi)星位點：BAT25，BAT26，D2S123，D5S346和D17S250。我們檢測了63例腫瘤的MSI情況并研究MSI和MSS病人的部分臨床病理指標。2/5及以上的位點出現(xiàn)不穩(wěn)定判為MSI-H。所有位點都穩(wěn)定的為MSS。在這個研究中我們還分析了散發(fā)性結直腸癌5個位點的LOH情況。 我們建立并優(yōu)化了一套通過檢測若干位點MSI情況的臨床分子診斷方法。正常胚系和腫瘤樣本經(jīng)多重PCR擴增，PCR

9、產物在毛細管電泳過程中依據(jù)大小不同被區(qū)分開，并識別腫瘤組織中長度異常的等位基因。 這種基于多重PCR模式的檢測方法優(yōu)于以往的聚丙烯酰胺凝膠電泳、放射自顯影等。CE是一種先進的熒光標記PCR擴增產物分析工具。 這種方法最初用于法醫(yī)鑒定，然而現(xiàn)在由于它敏感和相對快速的優(yōu)點在臨床檢驗工作中被日益重視。但由于多重熒光PCR-CE是一項精度要求相對較高的檢測技術，因此實驗操作中不少細節(jié)是影響檢測成敗的關鍵因素，并可能引起微衛(wèi)星數(shù)據(jù)

10、分析的錯誤解釋。在研究過程中我們分析并找到了這些常見問題的解決方法，對該技術進行相應的優(yōu)化。 同時我們改良了從福爾馬林固定組織中抽提DNA的方法，用于已知臨床診斷的檔案樣本的MSI分析。而較久一些的樣本因為結合臨床跟蹤隨訪而具有更高的價值。我們用這個方法抽提的DNA能用于多種分子研究，包括PCR反應、片段分析和直接測序等。由于DNA化學修飾以及隨著時間的遷移而發(fā)生持續(xù)的降解等原因，從福爾馬林固定組織中抽提質量高的DNA是比較困難

11、的。 福爾馬林固定液加入組織后能使脂質分離、蛋白質變性以及細胞膜、染色體和DNA的脆性度大大增加。我們將改良法和常規(guī)酚-氯仿-異戊醇法抽提的DNA的濃度和質量進行了比較。改良方法抽提DNA在數(shù)量上與常規(guī)法相似，但在DNA的質量和抽提成功率上明顯優(yōu)于常規(guī)法。用瓊脂糖凝膠電泳檢驗改良法抽提的DNA質量，得到的DNA片段大小都在500bp以上，大部分在1000bp以上。 用5個MSI敏感標記分析散發(fā)性結直腸癌的MSI及LOH情

12、況時，我們得到MSI總的檢出率為34.92％(22/63)，其中MSI-H16例(25.4％)，MSI-L6例(9.52％)，MSS41例(65.08％)。這些結果顯示MSI在散發(fā)性結直腸癌中可能是常見的事件。 微衛(wèi)星各位點突變率分別是D5S346(14.29％)，BAT26(9.52％)，BAT25(22.22％)，D17S250(23.81％)，D2S123(25.4％)。MSI腫瘤在所研究的臨床病理指標上與MSS腫瘤無差異

13、(P>0.05)。此外，LOH總檢出率為9.52％(6/63)。有2.44％(1/41)的MSS病例同時伴有其他位點LOH；22.73％(5/22)的MSI病例同時伴有其他位點的LOH。MSI結直腸癌與MSS結直腸癌相比具有更高的LOH發(fā)生率，存在顯著的統(tǒng)計學差異(P=0.008)。另外，18.75％(3/16)的MSI-H伴有LOH；33.33％(2/6)的MSI-L伴有LOH，兩者無統(tǒng)計學差異。 綜上所述，多重熒光PCR-C