利用RNA干擾技術(shù)抑制受磷蛋白基因表達(dá)治療慢性心力衰竭大鼠的研究.pdf

1、[背景]心力衰竭(heartfailure，HF)是各種心臟病的終末階段，其發(fā)病率、死亡率逐年增加，被稱為是心臟病最后的大戰(zhàn)場(chǎng)。研究發(fā)現(xiàn)心力衰竭時(shí)Ca2+穩(wěn)態(tài)紊亂，不僅影響心臟功能，也作為重要的信息遞質(zhì)參與心肌重塑。受磷蛋白(phospholamban，PLN)與肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶(sarcoplasmicreticulumCa2+-ATPase，SERCA2a)是與Ca2+運(yùn)轉(zhuǎn)有關(guān)的2種重要蛋白，SERCA2a將舒張期Ca2+重

2、吸收入肌漿網(wǎng)，促進(jìn)心肌舒張。磷酸化的PLN可增加SERCA2a的活性，失磷酸化則抑制。心力衰竭時(shí)SERCA2a下降，而PLN無明顯降低，PLN/SERCA2a比值升高，對(duì)SERCA2a活性的抑制增強(qiáng)，導(dǎo)致心功能的惡化。 本研究利用新興的RNA干擾技術(shù)(RNAinterference，RNAi)，設(shè)計(jì)了表達(dá)PLN小發(fā)夾環(huán)狀RNA(shorthairpinRNA，shRNA)的重組腺相關(guān)病毒載體(adeno-associatedvi

3、rus，AAV)，轉(zhuǎn)導(dǎo)入心力衰竭大鼠體內(nèi)，達(dá)到降解PLNmRNA，減少蛋白表達(dá)，增加PLN/SERCA2a比值，提高SERCA2a活性，改善心臟功能的目的。本研究共分三個(gè)部分進(jìn)行論述。 [實(shí)驗(yàn)第一部分] [目的]探索腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后心衰大鼠模型的入選標(biāo)準(zhǔn)。 [方法]22只大鼠隨機(jī)分為3個(gè)月和6個(gè)月組，每組再分為假手術(shù)亞組(n=5)和手術(shù)亞組(n=6)。術(shù)后3個(gè)月，6個(gè)月時(shí)分別行超聲心動(dòng)、血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定以及心肌病理

4、檢查。 [結(jié)果]3個(gè)月時(shí)，超聲檢查表明手術(shù)組大鼠左室舒張末徑(LVEDD)，左室收縮末徑(LVESD)增加，室間隔厚度(VSD)，左室后壁厚度(LVPWD)增厚，左室射血分?jǐn)?shù)(EF)及短軸縮短率(FS)降低，但與假手術(shù)組比較無顯著差異(P＞0.05)。血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)平均動(dòng)脈壓(MBP)，左室收縮壓(LVSP)，左室內(nèi)壓最大上升及下降速率(LV±dp/dtmax)降低，心率(HR)，左室舒張末壓(LVEDP)增加，與假手術(shù)組比較也

5、無顯著差異(P＞0.05)。同期心肌病理切片可見心肌肥大，有點(diǎn)狀心肌壞死，但無成片壞死、纖維化；6個(gè)月時(shí)手術(shù)組大鼠超聲指標(biāo)及血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)顯著惡化，較對(duì)照組有顯著差異(P＜0.05)，心肌病理檢查發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞出現(xiàn)壞死，纖維化較明顯；同時(shí)我們測(cè)定了超聲指標(biāo)與有創(chuàng)指標(biāo)的相關(guān)性，LVESD，LVEDD，LVPWD、IVS與±dp/dtmax呈負(fù)相關(guān)，EF、FS呈正相關(guān)，其中EF、FS與+dp/dtmax的相關(guān)系數(shù)分別為0.86，0.83，與-

6、dp/dtmax的相關(guān)系數(shù)分別為0.85，0.81。 [結(jié)論]超聲診斷大鼠心力衰竭是可靠的，據(jù)此制定了心衰大鼠的入選標(biāo)準(zhǔn)：1.大鼠腹主動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后6個(gè)月，出現(xiàn)進(jìn)食量減少，精神萎，少活動(dòng)，被毛無光澤、蓬松。2.超聲心動(dòng)圖指標(biāo)：LVESD＞0.55、LVEDD＞0.6，EF＜0.5，F(xiàn)S＜0.25。 [實(shí)驗(yàn)第二部分] [目的]研究rAAV2介導(dǎo)表達(dá)的PLNshRNA對(duì)慢性心力衰竭大鼠的治療作用。 [方法]設(shè)計(jì)

7、了2條針對(duì)PLNmRNA不同位點(diǎn)的rAAV2-phRi1和rAAV2-phRi2。假手術(shù)組14只為對(duì)照組，56只心衰大鼠隨機(jī)分為4組：(1).HF組，即心衰組，大鼠心包腔內(nèi)注射500μ1滅菌生理鹽水；(2).rAAV2攜帶綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescenceprotein，rAAV2-EGFP)組，心包腔內(nèi)注射混合溶液500μ1(1×1011vgrAAV2-EGFP，0.7mg膠原酶，350μ透明質(zhì)酸酶)；(

8、3).rAAV2-phRi1組，心包腔內(nèi)注射500μl混合液(1×1011vgrAAV2-phRi1，0.7mg膠原酶，350μ透明質(zhì)酸酶)；(4).rAAV2-phRi2組，心包腔內(nèi)注射500μ1混合液(1×1011vgrAAV2-phRi2，0.7mg膠原酶，350μ透明質(zhì)酸酶)。各組再隨機(jī)分為10天和30天亞組，每個(gè)亞組7只。采用經(jīng)腹心包腔內(nèi)注射法將rAAV2-phRi導(dǎo)入心衰大鼠體內(nèi)。導(dǎo)入后10天，30天進(jìn)行血流動(dòng)力學(xué)檢查，逆轉(zhuǎn)

9、錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法、Western-b1ot印跡法測(cè)定PLN，SERCA2amRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)，定磷法測(cè)定SERCA2a活性，冰凍切片觀察rAAV2-EGFP組心肌EGFP的表達(dá)判定轉(zhuǎn)導(dǎo)效果。 [結(jié)果]與對(duì)照組大鼠比較，心衰組血流動(dòng)力學(xué)顯著惡化，PLNmRNA降低，蛋白量無明顯變化，SERCA2amRNA及蛋白顯著降低，SERCA2a活性也降低，與對(duì)照組比較均有顯著差異(P＜0.05)；rAAV2-phRi

10、導(dǎo)入10天時(shí)，與HF組及rAAV2-EGFP組大鼠比較，rAAV2-phRi1及rAAV2-phRi2組血流動(dòng)力學(xué)稍有改善，PLNmRNA輕度降低，分別為18.76％/16.36％，蛋白量也輕度降低，但是無顯著差異(P＞0.05)，SERCA2amRNA及蛋白量，SERCA2a活性變化不大；導(dǎo)入30天時(shí)，與HF組大鼠比較，rAAV2-phRi1降低PLNmRNA達(dá)85.32％，rAAV2-phRi2降低了67.65％，相應(yīng)地蛋白分別減少

11、了78.82％/59.33％，均有顯著差異(P＜0.05)；rAAV2-phRi1及rAAV2-phRi2組的SERCA2amRNA及蛋白變化不大，因此PLN/SERCA2a降低，SERCA2a的活性分別為HF組的2.04倍和1.74倍；血流動(dòng)力學(xué)顯著改善(P＜0.05)；同時(shí)SERCA2a活性與PLN/SERCA2a，±dp/dtmax絕對(duì)值有很好的相關(guān)性；rAAV2-phRi1組±dp/dtmax絕對(duì)值的增加較rAAV2-phRi2

12、顯著(P＜0.05)；rAAV2-EGFP大鼠心肌冰凍切片可見彌漫綠色熒光蛋白表達(dá)。 [結(jié)論]經(jīng)腹心包腔內(nèi)注射基因轉(zhuǎn)導(dǎo)是有效的；2種rAAV2-phRi均能有效地抑制PLNmRNA的表達(dá)，減少蛋白表達(dá)，降低PLN/SERCA2a，提高SERCA2a的活性，改善心臟功能，且rAAV2-phRi1優(yōu)于rAAV2-phRi2。 [實(shí)驗(yàn)第三部分] [目的]研究rAAV2/1介導(dǎo)表達(dá)的PLNshRNA對(duì)慢性心力衰竭大鼠治療

13、作用的中長(zhǎng)期效果及安全性。 [方法]構(gòu)建表達(dá)PLNshRNA的rAAV2/1-phRi1。假手術(shù)組14只為對(duì)照組，21只心衰大鼠分為3組：(1).HF組，大鼠心包腔內(nèi)注射混合液500μl(1×1011vgrAAV2-EGFP，0.7mg膠原酶，350μ透明質(zhì)酸酶)；(2).rAAV2/1-phRi1低劑量組，大鼠心包腔內(nèi)注射含有rAAV2/1-phRi1的混合液500μ1(1×1011vg，0.7mg膠原酶，350μ透明質(zhì)酸酶)

14、；(3).rAAV2/1-phRi1高劑量組，大鼠心包腔內(nèi)注射rAAV2/1-phRi1的混合液500μ1(2×1011vg，0.7mg膠原酶，350μ透明質(zhì)酸酶)。各組再隨機(jī)分為30天，60天2個(gè)亞組，每個(gè)亞組7只。經(jīng)腹心包腔內(nèi)注射法進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。導(dǎo)入后30天，60天進(jìn)行血流動(dòng)力學(xué)檢查，RT-PCR法、Western-blot印跡法測(cè)定PLN，SERCA2amRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)，定磷法測(cè)定SERCA2a活性，冰凍切片觀察rAAV2-EG