同型半胱氨酸與動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊的關(guān)聯(lián)機(jī)制及他汀類藥物干預(yù)作用.pdf

1、高同型半胱氨酸(Hcy)血癥是動(dòng)脈粥樣硬化(AS)和動(dòng)、靜脈血栓形成的獨(dú)立危險(xiǎn)因子,可以誘發(fā)心腦血管疾病的發(fā)生,但至今缺乏理想有效的治療措施.目前國(guó)內(nèi)外尚無關(guān)于高Hcy血癥與AS易損斑塊的關(guān)聯(lián)機(jī)制及他汀類藥物干預(yù)作用的系統(tǒng)研究. 本研究擬建立ApoE基因缺陷高Hcy血癥AS動(dòng)物模型,利用他汀類或/和葉酸、維生素B<,12>干預(yù)性治療,觀察血漿中Hcy、血脂、炎癥因子水平以及斑塊大小、纖維帽、膠原比例、炎癥浸潤(rùn)程度的變化;并在離體水平觀察

2、不同Hcy刺激水平對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和大鼠血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)的增殖和凋亡影響及他汀類藥物對(duì)其的干預(yù)效應(yīng).上述研究結(jié)果將對(duì)伴有高Hcy血癥的高危心血管病患者的防治提供更有臨床價(jià)值的信息. [方法] 1、2﹪(wt/vol)L-蛋氨酸負(fù)荷誘導(dǎo).ApoE基因缺陷小鼠的高Hcy血癥的.AS易損斑塊模型,測(cè)定血清Hcy、血脂變化,并通過斑塊HE,elastica-Van Gieson,膠原染色及anti-M

3、AC3單克隆抗體標(biāo)記來檢測(cè)斑塊大小、纖維帽厚度、膠原比例和炎癥浸潤(rùn)程度的變化; 2、采用免疫組織化學(xué)和原位雜交方法檢測(cè)小鼠血管壁中NF-κB的表達(dá)和活化水平;免疫組化法檢測(cè)血管壁中PCNA、VCAM-1、ICAM-1和Caspase3表達(dá)情況;末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶原位標(biāo)記(TUNEL)法檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈斑塊中的細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI);并通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(EUSA)法檢測(cè)小鼠血漿中MCP-1、MMP-9、MMP-2、TIMP-1

4、和丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平,觀察Hcy對(duì)基因敲除小鼠體內(nèi)炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)程度和細(xì)胞增殖、凋亡的影響以及阿托伐他汀或/和葉酸、維生素B<,12>的干預(yù)作用. 3、原代培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞,予以Hcy或/和辛伐他汀處理24h后,用Annexin V染色加流式細(xì)胞術(shù)、DNA梯度法、TUNEL以及電鏡了解細(xì)胞凋亡狀態(tài);RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測(cè)caspase3、c-IAP1和c-IAP2的mRNA和蛋白質(zhì)水平

5、.同時(shí)予以Hcy、辛伐他汀、PKC抑制劑處理HUVEC不同時(shí)間點(diǎn)后,用TransAM<'TM>系統(tǒng)和凝膠電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)法檢測(cè)NF-кB P65轉(zhuǎn)錄因子的活性,蛋白質(zhì)印跡技術(shù)分析相關(guān)蛋白的表達(dá). 4、采用組織塊貼壁法原代培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs,用不同濃度的Hcy刺激大鼠VSMCs,在不同的時(shí)間點(diǎn)以四甲基偶氮唑鹽法檢測(cè)Hcy對(duì)VSMCs的活性細(xì)胞數(shù)量及增殖的影響;以5溴-2脫氧尿苷(BrdU)法檢測(cè)Hcy對(duì)大鼠VSM

6、Cs DNA合成的作用;流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞周期的變化；ELISA法測(cè)定膠原的含量.同時(shí)RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中c-myc和p27<'kipl>mRNA含量,蛋白印跡法檢測(cè)P27<'kipl>,cyclin D1,cyclinE、cyclin A和PCNA蛋白質(zhì)表達(dá). [結(jié)果]1、高蛋氨酸負(fù)荷可誘導(dǎo)ApoE基因缺陷小鼠主動(dòng)脈血管壁易損斑塊產(chǎn)生,且隨負(fù)荷提高和時(shí)間延長(zhǎng)程度加重;凋亡細(xì)胞在脂核區(qū)大量積聚;內(nèi)皮細(xì)胞水腫變性;SMCs由收

7、縮型向合成型轉(zhuǎn)變,胞漿疏松,水腫變性,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,胞漿內(nèi)空泡增多以及肌絲溶解;并可見核固縮的凋亡SMCs. 2、病變小鼠體內(nèi)主動(dòng)脈組織NF-кB 活化,血清和心肌組織MDA、血清MCP-1、MMP-9、MMP-2水平及主動(dòng)脈斑塊內(nèi)Caspase 3、PCNA、VCAM-1、ICAM-1水平和AI較對(duì)照組顯著升高,血清和心肌組織SOD和血清TIMP-1水平則顯著下降;阿托伐他汀干預(yù)后,NF-кB活化程度降低,血清和心肌組織MDA、

8、血清MCP-1、MMP-9、MMP-2水平及主動(dòng)脈斑塊內(nèi)Caspase 3、PCNA、VCAM-1、ICAM-1水平和AI較對(duì)照組顯著下降,血清和心肌組織SOD水平、血清TIMP-1水平顯著升高,炎癥和氧化應(yīng)激程度改善.而葉酸、維生素B<,12>無此作用. 3、0.5mmol/l和3mmol/L的Hcy均導(dǎo)致HUVEC凋亡,隨濃度增高而加重;并伴有caspase3活化增強(qiáng),c-IAPl和c-IAP2的mRNA和蛋白質(zhì)水平降低,辛

9、伐他汀可以上調(diào)c-IAPl和c-IAP2的表達(dá). 4.在高濃度Hcy(3mmol/L)刺激下,HUVEC的NF-K B的活化高峰出現(xiàn)在作用30'和6h時(shí);且伴有IKBα短暫快速的磷酸化及IKKα、IKKβ和PKC蛋白水平升高(P(0.05);MMP2、MMP-9及IL-1β顯著增加.而辛伐他汀和PKC抑制劑能顯著抑制NF-KB活化及其繼發(fā)的MMP-2、MMP-9及IL-1β升高. 5、0.025-0.05mmol/L的H

10、cy刺激VSMCs 12-48h后細(xì)胞增殖明顯(P<0.05),增殖細(xì)胞S期的百分含量較對(duì)照組和Hcy其它濃度組明顯增加;隨著Hcy濃度的升高,大鼠VSMCs合成DNA開始下降,至5mmol/L濃度時(shí)合成最低.隨著Hcy濃度的升高,細(xì)胞的I型和Ⅳ型膠原分泌呈現(xiàn)劑量依賴性的增高模式;Ⅲ型膠原有輕度的升高,無統(tǒng)計(jì)學(xué)上意義;高濃度的Hcy會(huì)減少VI型膠原的分泌,并呈劑量依賴性. 6、低濃度(0.05mmol/L)Hcy可誘導(dǎo)大鼠VSM

11、Cs c-myc mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)增加,P27<'Kipl>mRNA和蛋白水平快速下調(diào),并促進(jìn)cyclin D1、E、A和PCNA蛋白表達(dá)增加.經(jīng)10umol/L辛伐他汀作用24h后,P27<'kipl>表達(dá)與對(duì)照組相比明顯上調(diào),并顯著抑制了c-myc、 cyclin D1、E、A和PCNA的表達(dá). [結(jié)論] 1.高蛋氨酸飲食可誘導(dǎo)apoE基因缺陷小鼠出現(xiàn)高:Hcy血癥,從而生成AS易損斑塊,其NF-kB的活化程度

12、與斑塊的嚴(yán)重程度密切相關(guān);氧化應(yīng)激可直接導(dǎo)致NF-KB的活化,引起炎癥因子表達(dá);斑塊內(nèi)SMCs增生與凋亡現(xiàn)象并存.阿托伐他汀可以顯著增加小鼠易損斑塊的穩(wěn)定性. 2.Hcy誘導(dǎo)HUVEC凋亡,此種作用可能涉及caspase3相關(guān)途徑.辛伐他汀可促進(jìn)c-IAP系統(tǒng)的表達(dá),從而部分拈抗Hcy的作用. 3.Hcv能誘導(dǎo)HUVEC NF-κB系統(tǒng)活化,引起炎癥因子的表達(dá)與釋放,這些生物學(xué)效應(yīng)是通過PKC-NF-κ B信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)