利用不同方法對大鼠胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)染紅色熒光蛋白表達(dá)載體的研究.pdf

1、2008年Mia Buehr和Ping Li等成功建立了大鼠胚胎干細(xì)胞(Rat embryonicstem cells，rESCs)系，為干細(xì)胞研究領(lǐng)域提供了一個全新的研究模型。大鼠因其獨(dú)特的物種屬性及其在心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等特殊疾病的研究領(lǐng)域的獨(dú)特優(yōu)勢，一直以來被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等自然科學(xué)研究領(lǐng)域。而rESCs的出現(xiàn)為建立基因修飾的大鼠動物模型提供了更優(yōu)質(zhì)的實(shí)驗(yàn)材料，對大鼠轉(zhuǎn)基因研究方法的改進(jìn)起到關(guān)鍵作用。然而，對rESCs進(jìn)

2、行有效的遺傳操作是生產(chǎn)基因修飾的大鼠動物模型的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)通過將紅色熒光蛋白表達(dá)載體導(dǎo)入rESCs，尋找最優(yōu)的rESCs轉(zhuǎn)基因方法，為建立基因修飾的大鼠動物模型提供新的思路和方法，從而為rESCs在干細(xì)胞研究和異種移植等領(lǐng)域的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　目的：以大鼠胚胎干細(xì)胞(rESCs)為研究對象，通過比較利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔轉(zhuǎn)染及核轉(zhuǎn)染等轉(zhuǎn)染技術(shù)將表達(dá)紅色熒光蛋白（red fluorescenceprotein，RFP）的pEF1a

3、lpha-DsRed-Express2 Vector質(zhì)粒載體導(dǎo)入rESCs，并比較不同轉(zhuǎn)染技術(shù)的轉(zhuǎn)基因效率，以期尋找更好的rESCs轉(zhuǎn)基因方法，并探討轉(zhuǎn)基因過程對rESCs干細(xì)胞特性是否產(chǎn)生影響。
　　方法：利用脂質(zhì)體法、電穿孔法和核轉(zhuǎn)染法等轉(zhuǎn)染方法將表達(dá)紅色熒光蛋白(RFP)的pEF1 alpha-DsRed-Expres s2 Vector質(zhì)粒載體導(dǎo)入rESCs中，轉(zhuǎn)染后即運(yùn)用臺盼藍(lán)進(jìn)行染色，統(tǒng)計轉(zhuǎn)染后rESCs的細(xì)胞存活率;

4、并于48h后觀察rESCs內(nèi)紅熒光蛋白表達(dá)情況，從而比較不同轉(zhuǎn)染技術(shù)之間的轉(zhuǎn)染效率差異，確定效率最佳的轉(zhuǎn)染技術(shù)和轉(zhuǎn)染條件。然后，運(yùn)用堿性磷酸酶染色(AP)、反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)和免疫熒光染色等方法對轉(zhuǎn)染前后的rESCs進(jìn)行干細(xì)胞特性方面的檢測，探討轉(zhuǎn)基因過程對rESCs干細(xì)胞特性的影響。
　　結(jié)果：在本實(shí)驗(yàn)采取的幾種轉(zhuǎn)染方法中，核轉(zhuǎn)染技術(shù)能獲得較高的轉(zhuǎn)染效率;且在核轉(zhuǎn)染條件為A13時，可獲得最高的rESCs紅熒光蛋白轉(zhuǎn)染效