活性GlmU在分枝桿菌中生長必需性及其缺失后對細(xì)胞壁完整性影響的研究.pdf

1、本課題利用與結(jié)核分枝桿菌有相同細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，但生長快速且無致病性的恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis，Sm)mc<'2>155菌株作為實驗?zāi)Ｐ?，以glmU基因作為研究對象，并采用基于同源重組的插入突變方法使．glmU基因發(fā)生突變。目的是用基因敲除的方法證明結(jié)核分枝桿菌中g(shù)lmU基因是分枝桿菌生長過程中所必需的基因，并對glmU基因敲除菌株進(jìn)行了一系列的表型變化觀察及細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的聚糖組成成分分析，從而證明glmU基

2、因在分枝桿菌生長過程中具有重要作用，這將為其作為研發(fā)抗結(jié)核新藥的靶標(biāo)提供有力的證據(jù)。 本論文獲得以下結(jié)果： 1.SmglmU基因的擴增和克隆從TIGR基因數(shù)據(jù)庫(http://www.tigr.org/tdb/)獲得M smegmatis me<'2>155菌株的glmU基因的核苷酸序列。根據(jù)Sm glmU基因的核苷酸序列設(shè)計引物，用高保真LA Taq DNA聚合酶從mc<'2>155基因組中擴增Sm glmU基因及其上

3、游約500 bp的DNA序列，并將其克隆到pMD18-T的克隆質(zhì)粒上，用BcaBEST測序引物和M13引物對Sm glmU基因的兩端進(jìn)行DNA序列測定，將測序結(jié)果與已知的SmglmU 基因進(jìn)行相似性比較，得到與mc<'2>155基因組上Sm glmU基因序列完全一致的克隆質(zhì)粒。 2.條件性復(fù)制質(zhì)粒pPR27-xylE-Sm glmU::Kan<'R>的構(gòu)建將來自于質(zhì)粒pUC4K的Kan<'R>月克隆到Sm glmU基因內(nèi)部，產(chǎn)生

4、SmglmU::Kan<'R>突變基因。將Sm glmU::Kan<'R>月突變基因克隆到pPR27-xylE質(zhì)粒，構(gòu)建出條件性復(fù)制質(zhì)粒pPR27-xylE-Sm glmU::Kan<'R>。pPR27攜帶溫度敏感型復(fù)制子，該質(zhì)粒在30°C條件下可以復(fù)制，在42°C條件下不能復(fù)制。pPR27攜帶的sacB基因為負(fù)選擇標(biāo)記，該基因表達(dá)產(chǎn)物蔗糖6-果糖基轉(zhuǎn)移酶(Levansucrase)能夠分解蔗糖，產(chǎn)生對細(xì)菌生長有害的聚果糖，使細(xì)菌死亡。

5、xy/E基因產(chǎn)物是兒茶酚2，3-氧化還原酶，它能氧化兒茶酚成黃色的化合物，使菌落呈現(xiàn)金黃色。 3.營救質(zhì)粒的構(gòu)建營救質(zhì)粒攜帶正常的M tuberculosis glmU基因，其作用是在mc<'2>155 glmU基因敲除菌株中補償突變的glmU基因的功能。本實驗用高保真LA Taq DNA聚合酶分別從M tuberculosis H37Rv菌株基因組中擴增Tb glmU基因，構(gòu)建營救質(zhì)粒pCG76-Phsp60-Tb glmU。

6、pCG76為分枝桿菌表達(dá)質(zhì)粒，pCG76攜帶溫度敏感型復(fù)制子，即該質(zhì)粒在30°c條件下可以復(fù)制，在42°c條件下不能復(fù)制。TbglmU基因的表達(dá)受來源于分枝桿菌BCG熱休克蛋白60的啟動子Phsp60控制。pCG76-phsp60-Tb glmU營救質(zhì)粒用于證明TbglmU是否為分枝桿菌生長相關(guān)基因。 4.第一次同源重組突變菌株mc<'2>155 glmU SCO-1的篩選將條件復(fù)制性質(zhì)粒pPR27-xylE-Sm glmU::

7、Kan<'R>電轉(zhuǎn)化到mc<'2>155感受態(tài)細(xì)胞中。依據(jù)pPR27-xylE-Sm glmU::Kan<'R>質(zhì)粒在30°C時能復(fù)制，在42°C時不能復(fù)制，在42°C條件下培養(yǎng)攜帶pPR27-xylE-Sm glmU::Kan<'R>質(zhì)粒的mc<'2>155，迫使pPR27-xylE-Sm glmU::Kan<'R>質(zhì)粒的Sm glmU::Kan<'R>與mc<'2>155基因組中的SmglmU發(fā)生同源重組，使Sm glmU::Kan

8、<'R>以及sacB基因、xylE基因整合到mc<'2>155基因組中。用地高辛標(biāo)記的Sm glmU探針(DIG-Sm glmU)對經(jīng)過Sinai酶切的第一次重組菌落的基因組DNA進(jìn)行Southern雜交分析，當(dāng)結(jié)果中出現(xiàn)預(yù)期的雜交條帶為發(fā)生第一次同源重組的突變菌株mc<'2>155 glmU SCO-1(the firstsingle crossover)。 5．第二次同源重組突變菌株mc<'2>155 glmU SCO-2(glmU

9、基因敲除)的篩選將攜帶 Tb glmU 基因的營救質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到mc<'2>155 glmU SCO-1 感受態(tài)細(xì)胞中，在30℃條件下，在含10﹪蔗糖的選擇性LB瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的mc<'2>155glmU SCO-1，由于pPR27-xylE-Sm glmU∶∶Kan<'R>的 sacB基因和 xylE 基因也被整合到mc<'2>155 glmU SCO-1 基因組中，sacB基因的表達(dá)產(chǎn)物蔗糖6-果糖基轉(zhuǎn)移酶能水解蔗糖，產(chǎn)生引起mc<

10、'2>155 glmU SCO-1 致死的聚果糖，在這種選擇壓力下，mc<'2>155 glmU SCO-1 基因組中的Sm glmU∶∶Kan<'R>與Sm glmU發(fā)生第二次同源重組，將Sm glmU基因、scaB基因以及．xylE基因從mc<'2>155 glmU SCO-1 基因組中刪除并被核酸酶水解，基因組中只存在Sm glmU∶∶Kan<'R>。營救質(zhì)?？梢栽趍c<'2>155glmU KOT 突變菌株中表達(dá)出 Tb Glm

11、U蛋白質(zhì)，從而補償基因組上失活的SmGlmU的生物學(xué)作用。同樣地，應(yīng)用Southem印跡方法篩選出mc<'2>155 glmUSCO-2(the second single crossover)，即 Sm glmU 基因敲除菌株 mc<'2>155 glmU KOT(glmUknock out，基因敲除)6．生長曲線的測定在30℃及42℃條件下，每間隔24小時測定mc<'2>155 glmU KOT 突變菌株在600 nm處的光吸收值，

12、并繪制生長曲線。生長曲線的結(jié)果表明，對照的野生型菌株即能在30℃條件下又能在42℃條件下生長；而突變菌株在30℃條件下能夠生長，而在42℃條件下卻失去生長能力。因而說明了結(jié)核分枝桿菌的glmU基因為分枝桿菌生長相關(guān)基因。 7．溫度轉(zhuǎn)換后生長曲線和菌落形成單位(CFU)曲線的繪制mc<'2>155 glmU KOT菌株和野生型的mc<'2>155菌株在30℃條件下生長至OD<,600>為0.09，然后轉(zhuǎn)變溫度為42℃后繼續(xù)生長，每

13、隔24小時測定其在600 nm的吸光度值，并繪制生長曲線。溫度轉(zhuǎn)換后的生長曲線結(jié)果顯示，野生型的mc<'2>155菌株，溫度的轉(zhuǎn)換對其生長沒有明顯的影響；而mc<'2>155 glmU KOT、菌株，在轉(zhuǎn)變溫度后的24小時之內(nèi)，細(xì)菌會繼續(xù)生長，并達(dá)到吸光度值的最高值；然而繼續(xù)延長時間，細(xì)菌不再生長，其吸光度值持續(xù)下降。對mc<'2>155 glmU KOT 菌株同時進(jìn)行對可活菌落進(jìn)行計數(shù)的菌落形成單位(colony forming un

14、it，CFU)測定，結(jié)果表明mc<'2>155 glmU KOT 菌株的吸光度值與CFU具有相同的趨勢，即都在轉(zhuǎn)變溫度后的24小時左右達(dá)到最高值，接下來持續(xù)下降。此結(jié)果進(jìn)一步證實glmU基因為分枝菌酸生長所必需的基因，且mc<'2>155 glmU KOT 菌株在溫度轉(zhuǎn)變后光吸收值的降低是由于細(xì)菌的死亡。 8．應(yīng)用顯微鏡技術(shù)對細(xì)胞形態(tài)的觀察mc<'2>155 glmU KOT菌株的生長條件與CFU測定實驗中細(xì)菌的生長條件相同，收

15、獲細(xì)菌后，應(yīng)用光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察其形態(tài)。光鏡的結(jié)果顯示，當(dāng)細(xì)胞生長在30°C時細(xì)胞呈野生型細(xì)菌般的長棒狀；但當(dāng)細(xì)胞的生長溫度轉(zhuǎn)變?yōu)?2°C后，雖然初始時細(xì)胞依然能維持棒狀，但細(xì)胞長度卻變的比野生型的細(xì)胞短很多；隨著在42°C生長時間的增加，細(xì)胞逐漸開始變?yōu)榍蛐?，并且時間越長球形細(xì)胞所占的比例越大。 9.應(yīng)用氣相色譜對細(xì)胞壁糖組分的分析及應(yīng)用高效液相Dionex陰離子交換層析對阿拉伯糖組分分析mc<'2>155 glm

16、U KOT菌株生長在30°C至其吸光度值為0　09后，轉(zhuǎn)移到42°C生長3天，提取細(xì)菌細(xì)胞壁的核心組分-分枝菌酸-聚阿拉伯半乳糖-肽聚糖(mycolic acid，arabinogalactan，peptidoglycan，mAGP)，然后應(yīng)用氣相色譜(GasChromatography，GC)分析mAGP中糖的組成成分。本實驗中以mc<'2>155 glmUKOT菌株生長在30°C的細(xì)菌作為對照。GC結(jié)果表明，在活性GlmU缺失的mc

17、<'2>155 glmU KOT菌株的mAGP中，阿拉伯糖含量明顯增加，半乳糖含量略有增加但不明顯;對照菌株與mc<'2>155野生型菌株相比沒有顯著不同。 用堿裂解法移除mAGP中的分枝菌酸和肽聚糖，使之成為可溶性的聚阿拉伯半乳糖(arabinogalactan，AG)。采用來自纖維單胞菌(Cellumonas gelida)的阿拉伯糖內(nèi)切酶消化可溶性AG，并應(yīng)用Dionex陰離子交換層析柱分析被內(nèi)切酶消化的樣品，結(jié)果表明，m