利用抗AcMNPV P74多克隆抗體對(duì)P74跨膜區(qū)宿主特究異性的研究.pdf

1、　　本文制作了抗AcMNPVP74的多克隆抗體，以檢測(cè)替換后的重組蛋白ASP74在病毒粒子上定位的情況。首先通過PCR擴(kuò)增出AcMNPVp74ORF全長片段，將它插入到表達(dá)載體pET28a中，將構(gòu)建好的重組子轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在，表達(dá)量并不高。為了獲得高表達(dá)量的重組蛋白以進(jìn)行免疫，又構(gòu)建了含有P74N末端親水區(qū)序列的重組質(zhì)粒pET21b-p74(2-194)，表達(dá)產(chǎn)物仍是以包涵體形式存在

2、，表達(dá)量很高，達(dá)到總體蛋白的35％。通過去垢劑和低濃度尿素處理后，獲得較純的包涵體粗提物。用包涵體粗提物與弗氏佐劑混合乳液免疫雄性純種新西蘭兔。采用皮下多點(diǎn)注射免疫六次后，從頸動(dòng)脈采血。分離出抗血清，并進(jìn)行純化。利用制備的血清可以檢測(cè)到野生型病毒P74蛋白的表達(dá)，這表明用包涵體直接免疫的方案是可行的。吳無畏利用RT-PCR證明了重組后病毒部分替換的p74進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄，但是卻喪失了口服感染能力，表明P74C末端跨膜區(qū)也是影響宿主范圍的因子之

3、一。本文在蛋白水平進(jìn)一步研究口服能力喪失的原因，利用抗血清無法檢測(cè)到病毒粒子上有替換后的重組蛋白ASP74的存在，推測(cè)是由于SpltMNPVP74的跨膜區(qū)無法將蛋白定位至對(duì)于AcMNPV敏感的Sf9細(xì)胞核內(nèi)環(huán)狀區(qū)?？缒さ鞍兹绻麩o法正確定位在膜上，就會(huì)被分子伴侶識(shí)別，從而導(dǎo)致替換后的蛋白ASP74被降解?！　”緦?shí)驗(yàn)所做工作的意義在于：首先，初步證實(shí)了包涵體蛋白作為免疫原的可行性，這一操作避免了蛋白質(zhì)復(fù)性復(fù)雜的工藝流程。其次，為用免疫學(xué)手