骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合硫酸軟骨素酶ABC對大鼠坐骨神經(jīng)缺損修復(fù)作用的研究.pdf

1、目的：
　　 周圍神經(jīng)長距離缺損的修復(fù),一直是臨床上較為棘手的難題。修復(fù)長距離神經(jīng)缺損的基礎(chǔ)是合適的神經(jīng)移植物。隨著科學(xué)研究的發(fā)展應(yīng)用人工合成生物材料,如硅膠管、PGLA、PLLA等在修復(fù)神經(jīng)再生中取得了相應(yīng)的橋接神經(jīng)的作用,但由于缺乏組織相容性、神經(jīng)的天然結(jié)構(gòu)和生長因子,難以達(dá)到理想的功能恢復(fù)。許多研究者發(fā)現(xiàn)脫細(xì)胞神經(jīng)移植物在用于神經(jīng)損傷的修復(fù)中優(yōu)于其他人工制備的移植物,由于脫去了周圍神經(jīng)的細(xì)胞成分,保存了神經(jīng)天然結(jié)構(gòu),具有較

2、好的組織相容性,脫細(xì)胞神經(jīng)移植物被認(rèn)為是修復(fù)長距離神經(jīng)缺損的良好的移植物。
　　 近年來種子細(xì)胞移植被認(rèn)為是促進(jìn)周圍神經(jīng)再生的重要方法之一。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一種成體干細(xì)胞,具有體外分離培養(yǎng)方便、自我增殖、增殖速度快并且具有多向分化的特征,可向骨、軟骨、脂肪、肌肉、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元等分化。BMSCs還可以合成和分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotr

3、ophic factor,NF),包括神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、睫狀節(jié)神經(jīng)細(xì)胞營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factors,CNTF)、膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell linederived factor,GDNF)和基本成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibrobl

4、ast growth factor,bFGF)等。許多研究證實BMSCs作為神經(jīng)組織工程的種子細(xì)胞,能夠成功修復(fù)中樞和周圍神經(jīng)損傷。
　　 周圍神經(jīng)損傷后再生的影響因素主要有以下幾個方面:(1)神經(jīng)生長抑制因子阻止神經(jīng)再生,如抑制因子硫酸軟骨素蛋白聚糖(Chondroitin sulfateproteoglycans,CSPGs)具有抑制軸突生長的作用,它不僅存在于中樞神經(jīng)內(nèi),在周圍神經(jīng)中也大量存在,廣泛分布在周圍神經(jīng)鞘和神經(jīng)間

5、質(zhì)內(nèi),在周圍神經(jīng)損傷后其表達(dá)顯著上調(diào),抑制軸突再生。而硫酸軟骨素酶ABC(ChondroitinaseABC,ChABC)可以降解CSPGs上的葡糖胺聚糖(GAG)側(cè)鏈,從而降解CSPGs。Zuo和Tatsuya等發(fā)現(xiàn)經(jīng)ChABC處理脫細(xì)胞神經(jīng)支架后,可以促進(jìn)再生軸突通過神經(jīng)和支架的吻合口,并能顯著增加脫細(xì)胞神經(jīng)支架內(nèi)再生軸突的數(shù)量和生長長度。(2)促進(jìn)神經(jīng)生長的因子促進(jìn)神經(jīng)再生。周圍神經(jīng)損傷后,神經(jīng)局部、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和肌肉的微環(huán)境會發(fā)

6、生一系列復(fù)雜的改變,調(diào)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子和某些肽類物質(zhì)如血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin generelated peptide,CGRP)等表達(dá),進(jìn)而對神經(jīng)再生起一定的協(xié)同促進(jìn)作用,這些促進(jìn)神經(jīng)生長的因子的表達(dá)變化與神經(jīng)損傷后的再生過程密切相關(guān)。
　　 周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)和再生機(jī)理非常復(fù)雜,受許多因素的影響,許多實驗證明單一治

7、療方法雖有助于軸突再生和功能恢復(fù),但效果并不理想,聯(lián)合治療能克服多種抑制周圍神經(jīng)軸突再生的因素。因此,本實驗選用大鼠脫細(xì)胞坐骨神經(jīng)(acellular rat sciatic nerve,ARSN)提供適宜軸突生長的通路,ChABC降解ARSN中抑制軸突生長的因子CSPGs,再將具有分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子功能的種子細(xì)胞BMSCs植入ChABC處理的ARSN內(nèi),用來橋接神經(jīng)缺損,檢測術(shù)后神經(jīng)再生和功能恢復(fù)的效果及再生組織中促進(jìn)神經(jīng)生長的因子的表

8、達(dá),探討其修復(fù)神經(jīng)再生機(jī)制,為周圍神經(jīng)損傷的治療提供新的思路。
　　 實驗方法：
　　 一、制備ChABC處理的ARSN及檢測
　　 采用化學(xué)萃取脫細(xì)胞方法制備大鼠ARSN,將ARSN浸泡在100μl PBS(2U/mlChABC),水浴16小時(37℃),制備ChABC處理的ARSN。免疫組織化學(xué)染色觀察神經(jīng)支架內(nèi)層粘連蛋白(laminin,LN)和CSPGs蛋白表達(dá),掃描電鏡觀察神經(jīng)支架基底膜結(jié)構(gòu),皮下埋置實

9、驗和CD3免疫組化染色檢測神經(jīng)支架的免疫相容性。
　　 二、構(gòu)建BMSCs復(fù)合ChABC處理的ARSN神經(jīng)移植體
　　 體外培養(yǎng)擴(kuò)增BMSCs,傳至三代,分別在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液和成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng),茜草素紅染色和油紅0染色鑒定。PKH26標(biāo)記BMSCs,將標(biāo)記的BMSCs(2×107/ml)注入ChABC處理的ARSN后復(fù)合培養(yǎng)5d,倒置顯微鏡和掃描電鏡觀察BMSCs在支架內(nèi)粘附情況。MTT法檢測神經(jīng)支架的細(xì)胞毒性

10、。熒光顯微鏡觀察支架內(nèi)PKH26標(biāo)記的BMSCs分布和存活情況。免疫熒光染色和實時熒光定量PCR分別檢測神經(jīng)移植體內(nèi)NGF和BDNF蛋白及基因的表達(dá)。
　　 三、實驗動物分組
　　 用ARSN組、ChABC組、BMSCs組、ChABC+BMSCs組的神經(jīng)移植體橋接長10mm坐骨神經(jīng)兩斷端問的缺損,術(shù)后8w取材。
　　 四、評估神經(jīng)再生情況
　　 1、坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)檢測。2、用電生理方法檢測動作

11、電位潛伏期、傳導(dǎo)速度和波幅。3、脛前肌濕重比率測定。4、神經(jīng)移植體檢測:熒光顯微鏡追蹤神經(jīng)移植體內(nèi)PKH-26標(biāo)記的BMSCs;免疫熒光法檢測神經(jīng)移植體中NF-200、S100、GFAP、VEGF、CD34、NGF、BDNF的蛋白表達(dá);實時熒光定量PCR檢測神經(jīng)移植體中NGF、BDNF mRNA的表達(dá);甲苯胺藍(lán)染色和透射電鏡檢測神經(jīng)移植體中有髓神經(jīng)纖維數(shù)目、軸突直徑和髓鞘厚度。5、免疫組化法檢測患側(cè)脛前肌和患側(cè)L4脊髓前角內(nèi)運(yùn)動神經(jīng)元V

12、EGF、NGF、BDNF蛋白表達(dá);實時熒光定量PCR檢測患側(cè)脛前肌和患側(cè)L4脊髓內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(neurotrophin-3,NT-3)、BDNF、CGRP、CNTF、bFGF、GDNF、NGF和VEGF mRNA表達(dá);患側(cè)脛前肌膽堿酯酶染色計數(shù)運(yùn)動終板。6、L4～5脊神經(jīng)節(jié)HRP逆行標(biāo)記檢測。7、患側(cè)足掌皮膚觸覺小體HE染色。
　　 五、統(tǒng)計學(xué)分析
　　 所得數(shù)據(jù)以采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析

13、,數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示。對于正態(tài)分布數(shù)據(jù),組間均數(shù)比較采用單因素方差分析檢驗;對于非正態(tài)分布數(shù)據(jù),組間均數(shù)比較采用Kruskal-Wallis H檢驗。P＜0.05為具有顯著性差異。
　　 實驗結(jié)果：
　　 1、正常神經(jīng)內(nèi)CSPGs呈弱陽性表達(dá),ARSN組CSPGs呈強(qiáng)陽性表達(dá),而ChABC組支架CSPGs表達(dá)陰性,三組間差異顯著。ChABC組術(shù)后4w、8w支架內(nèi)CSPGs表達(dá)極少,同時間點(diǎn)顯著低于ARSN

14、組。LN表達(dá)在ChABC組、ARSN組和正常神經(jīng)組間無顯著性差異。掃描電鏡觀察可見ChABC組和ARSN組支架基底膜管結(jié)構(gòu)保留完整。皮下埋置1w和2w,ChABC組和ARSN組支架內(nèi)僅有少量的CD3陽性T淋巴細(xì)胞亞群的浸潤,同時間點(diǎn)顯著低于正常神經(jīng)組。
　　 2、在倒置顯微鏡下可見剛接種的BMSCs呈圓形,貼壁后為成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞,10d后能夠達(dá)到90％融合。用茜草素紅和油紅0分別對向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)的BMSCs進(jìn)行染色發(fā)

15、現(xiàn)各自向誘導(dǎo)的細(xì)胞分化,即有紅色的骨基質(zhì)的沉積和脂滴形成。MTT法檢測1～7d期間,陰性對照組、BMSCs組和BMSCs+ChABC組細(xì)胞生長曲線趨勢相似,BMSCs增殖明顯,各時間點(diǎn)三組間OD值比較無差異。BMSCs和ChABC處理的ARSN復(fù)合培養(yǎng)5d后,倒置顯微鏡和掃描電鏡觀察BMSCs在ChABC處理的ARSN內(nèi)粘附良好。BMSCs組和BMSCs+ChABC組支架內(nèi)可見PKH26標(biāo)記的紅色的BMSCs均勻分布,BMSCs組和BM

16、SCs+ChABC組神經(jīng)移植體內(nèi)均有NGF、BDNF蛋白和mRNA表達(dá),二組間表達(dá)無顯著差異,而ARSN組未見NGF和BDNF表達(dá)。
　　 3、神經(jīng)移植術(shù)后,與ARSN組比較,ChABC組、BMSCs組和ChABC+BMSCs組坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)增高,神經(jīng)傳導(dǎo)速度增快,波幅增大,脛前肌濕重增加,有髓神經(jīng)纖維數(shù)目、髓鞘厚度、軸突直徑和神經(jīng)纖維數(shù)目增加,其中ChABC+BMSCs組作用更顯著。ChABC+BMSCs組神經(jīng)移植

17、體中段PKH26標(biāo)記細(xì)胞數(shù)高于BMSCs組。
　　 4、與ARSN組比較,ChABC組術(shù)后4w和8w神經(jīng)移植體內(nèi)神經(jīng)纖維數(shù)目顯著增加。
　　 5、ChABC+BMSCs組和BMSCs組神經(jīng)移植體內(nèi)S100、GFAP、VEGF、CD34、NGF、BDNF的蛋白表達(dá)均顯著高于ChABC組和ARSN組。
　　 6、ChABC+BMSCs組和BMSCs組患側(cè)L4脊髓前角內(nèi)BDNF蛋白表達(dá)較ChABC組和ARSN組顯著增加

18、,ChABC+BMSCs組VEGF蛋白表達(dá)高于其他三組,NGF蛋白表達(dá)在各組間無顯著差異。實時熒光定量PCR檢測患側(cè)L4脊髓內(nèi)NF mRNA表達(dá)情況,與ARSN組和ChABC組比較,BMSCs組和ChABC+BMSCs組BDNF、CGRP、CNTF和NT-3mRNA相對表達(dá)增高,ChABC+BMSCs組VEGF mRNA相對表達(dá)高于其他三組,而bFGF、GDNF和NGF mRNA相對表達(dá)在各組間無顯著差異。
　　 7、ChABC

19、+BMSCs組和BMSCs組患側(cè)脛前肌BDNF蛋白表達(dá)較ARSN組和ChABC組顯著增加,ChABC+BMSCs組VEGF蛋白表達(dá)高于其他三組,NGF蛋白表達(dá)在各組間無顯著差異。Realtime PCR檢測患側(cè)脛前肌中NF表達(dá)情況,與ARSN組和ChABC組比較,BMSCs組和ChABC+BMSCs組患側(cè)脛前肌內(nèi)BDNF、CGRP、CNTF、NT-3 mRNA相對表達(dá)增高,ChABC+BMSCs組VEGF mRNA相對表達(dá)高于其它三組。

20、bFGF、GDNF、NGF mRNA相對表達(dá)在各組間無顯著差異
　　 8、各組患側(cè)脛前肌可見重新形成的運(yùn)動終板結(jié)構(gòu);HRP逆行標(biāo)記可見后根神經(jīng)節(jié)內(nèi)棕色標(biāo)記的感覺神經(jīng)元;足底皮膚可見觸覺小體。與ARSN組比較,ChABC組、BMSCs組和ChABC+BMSCs組運(yùn)動終板、感覺神經(jīng)元和觸覺小體的數(shù)量增高。
　　 結(jié)論：
　　 1、ChABC治療能有效降解ARSN中CSPGs,對ARSN基底膜結(jié)構(gòu)沒有影響,ChABC處

21、理的ARSN有良好的免疫相容性
　　 2、ChABC處理的ARSN對BMSCs無細(xì)胞毒性,有利于BMSCs的粘附、存活及NGF和BDNF的分泌。
　　 3、ChABC治療可增加軸突長入脫細(xì)胞神經(jīng)支架的數(shù)量,促進(jìn)神經(jīng)支架內(nèi)BMSCs的存活和增殖。
　　 4、BMSCs促進(jìn)脫細(xì)胞神經(jīng)支架修復(fù)神經(jīng)再生的機(jī)制可能與增加相應(yīng)的脊髓和肌肉內(nèi)BDNF、CGRP、CNTF、NT-3的表達(dá)有關(guān)。
　　 5、BMSCs聯(lián)合C