基于Ii分子的HCV-NS3 Th1表位基因疫苗的設(shè)計(jì)及功能研究.pdf

1、丙型病毒性肝炎是嚴(yán)重危害人類健康的傳染病。全球丙肝病毒(HCV)的感染人數(shù)約為一億七千萬(wàn)，占世界人口總數(shù)的1-3％。在感染的人群中，約80％轉(zhuǎn)為慢性，20％發(fā)展為肝硬化和肝細(xì)胞癌；我國(guó)的HCV感染者占人口總數(shù)的3.2％，估計(jì)感染者總數(shù)約為4000萬(wàn)。 自從1989年HCVcDNA首次被克隆成功至今，對(duì)HCV的分子生物學(xué)研究取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。目前已明確，HCV為單股正鏈RNA病毒，屬黃病毒科，全長(zhǎng)約9600個(gè)核苷酸，ORF區(qū)編

2、碼3010個(gè)氨基酸的多聚蛋白前體，經(jīng)過(guò)宿主和病毒本身基因編碼的蛋白酶裂解為十個(gè)功能性片段，其中四個(gè)為結(jié)構(gòu)蛋白，分別是核心蛋白C、包膜蛋白E1、E2以及P7；六個(gè)為非結(jié)構(gòu)蛋白，分別是NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。盡管HCV的基本結(jié)構(gòu)已經(jīng)清楚，但是HCV的防治仍然是世界性的難題，α干擾素和病毒唑聯(lián)合治療是唯一的治療方法，但這種治療方法只對(duì)不到50％的患者顯效，且具有費(fèi)用高、易復(fù)發(fā)和副作用多等缺陷；尤其是我國(guó)流行的H

3、CV-Ⅱ/1b型，對(duì)α干擾素的治療應(yīng)答最低，因此發(fā)展治療和預(yù)防性丙肝疫苗，對(duì)于預(yù)防HCV感染和控制感染者的病情發(fā)展，都具有重要的意義。 HCVNS3蛋白具有絲氨酸蛋白酶和解旋酶活性，參與病毒蛋白翻譯后加工，為病毒復(fù)制所必須，針對(duì)NS3蛋白的T細(xì)胞應(yīng)答與自限性感染關(guān)系密切。目前公認(rèn)位于NS3區(qū)的1248-1261位氨基酸殘基為CD4+Th1細(xì)胞表位，而且該表位對(duì)于MHC限制性具有廣譜特異性。本研究以BALB/c小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，

4、以MHCⅡ抗原提呈通路中的分子伴侶Ii鏈為載體，用HCV-NS3的1248-1261表位替換Ii鏈的CLIP編碼片段構(gòu)建了內(nèi)源性靶向基因疫苗，同時(shí)克隆了BALB/c小鼠的抗原提呈分子I-Adαβ鏈分子的編碼基因，在細(xì)胞水平研究了所構(gòu)建的基因疫苗與抗原提呈分子之間的相互作用，并用構(gòu)建的基因疫苗免疫BALB/c小鼠，研究了免疫小鼠的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，在細(xì)胞水平和體內(nèi)免疫研究的基礎(chǔ)上，為了對(duì)疫苗的有效性作出初步的評(píng)價(jià)，用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HCV-

5、NS3的BALB/c小鼠SP2/0細(xì)胞構(gòu)建了荷瘤小鼠模型，用所構(gòu)建的疫苗對(duì)荷瘤小鼠進(jìn)行了免疫治療，結(jié)果表明：1內(nèi)源性靶向基因疫苗在真核細(xì)胞合成后，HCV-NS3Th1表位能夠與MHC-Ⅱ抗原提呈分子結(jié)合，形成抗原表位/MHCⅡ分子復(fù)合體。 2形成的抗原表位/MHCⅡ分子復(fù)合體能夠到達(dá)細(xì)胞表面。 3BALB/c小鼠免疫的結(jié)果顯示，內(nèi)源性靶向基因疫苗主要刺激小鼠產(chǎn)生Th1類型的細(xì)胞免疫；而非靶向?qū)φ找呙缰饕碳ば∈螽a(chǎn)生的是T

6、h2類型的細(xì)胞免疫。 4對(duì)HCV-NS3荷瘤小鼠的免疫治療顯示，內(nèi)源性靶向基因疫苗在抑制腫瘤生成、限制腫瘤生長(zhǎng)、延長(zhǎng)成瘤小鼠的生存時(shí)間等方面優(yōu)于非靶向?qū)φ找呙纭＞C上所述，本研究在國(guó)內(nèi)外首次以Ii鏈作為載體構(gòu)建了針對(duì)HCV-NS3的Th1表位內(nèi)源性靶向基因疫苗，細(xì)胞水平和體內(nèi)水平以及初步療效的研究結(jié)果都表明，以Ii鏈作為載體誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生Th1類型細(xì)胞免疫是可行的，這種方法有望為HCV的防治提供一種可行的途徑，在治療性HCV基因疫苗