抗銀屑病藥動(dòng)物模型的建立及腫瘤壞死因子-受體超家族在銀屑病發(fā)病中的作用探討.pdf

1、銀屑病是一種發(fā)病率較高的紅斑鱗屑性皮膚病，其治療復(fù)雜而棘手。其發(fā)病機(jī)理尚未完全明確，目前主要認(rèn)為是遺傳背景下的一種由T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病。半個(gè)多世紀(jì)以來，有不同的動(dòng)物模型被用于研究銀屑病，但都因?yàn)閮H僅只反映某一方面的機(jī)制而無法通用。在Th1/Th2疾病理論體系下，銀屑病中Th1型細(xì)胞及其細(xì)胞因子占優(yōu)勢，屬于Th1型疾病，尋找一種能體現(xiàn)銀屑病這一免疫學(xué)特點(diǎn)的動(dòng)物模型將對銀屑病的研究具有重大意義。
　　 通過運(yùn)用豬甲狀腺球蛋白

2、、弗氏佐劑及高碘飲水，我科實(shí)驗(yàn)人員在先前的研究中已經(jīng)成功地在Wistar大鼠身上建立了實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎(experimentalautoimmune thyroiditis，EAT)模型，本研究繼續(xù)采用該方法建立EAT模型，并作了適當(dāng)改進(jìn)。以血清抗甲狀腺球蛋白抗體(anti-thyroglobulin antibody，TGAb)水平及甲狀腺組織病理改變評(píng)價(jià)不同抗銀屑病藥物的療效；分離外周血單一核細(xì)胞(peripheral bl

3、ood mononuclear cells，PBMCs)，利用基因芯片技術(shù)高通量、高準(zhǔn)確性、高靈敏度的優(yōu)勢，從整體細(xì)胞因子免疫網(wǎng)絡(luò)水平對不同抗銀屑病藥物調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡的機(jī)理進(jìn)行研究，并對若干指標(biāo)以realtime PCR進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 針對基因芯片發(fā)現(xiàn)的若干腫瘤壞死因子/受體超家族成員的變化，在銀屑病患者身上驗(yàn)證。Realtime PCR檢測其在外周血及皮損中mRNA表達(dá)量，免疫組化檢測皮損中相應(yīng)蛋白的表達(dá)水平，從而探

4、討腫瘤壞死因子/受體超家族在銀屑病發(fā)病機(jī)理中的可能作用。
　　 第一部分用實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎模型評(píng)價(jià)抗銀屑病藥物療效的可行性探討
　　 目的:驗(yàn)證EAT模型的建立方法，研究不同抗銀屑病藥物治療該模型的療效，探討其作為抗銀屑病藥物療效評(píng)價(jià)活體模型的可行性。
　　 方法:運(yùn)用豬甲狀腺球蛋白、弗氏佐劑以及高碘(0.05％)飲水在健康Wistar大鼠上建立EAT模型。隨后EAT模型大鼠隨機(jī)分成模型組、環(huán)孢素組、依曲

5、替酸組及沙利度胺組，給予相應(yīng)藥物混懸液灌胃治療30天(模型組給予生理鹽水，環(huán)孢素組每天每只給予環(huán)孢素A20.625mg/kg，依曲替酸組給予依曲替酸2.75mg/kg，沙利度胺組給予沙利度胺6.875mg/kg)。同時(shí)以正常大鼠(不予灌胃治療)作為正常對照組。建模完成及藥物治療結(jié)束后兩次檢測血清中TGAb抗體水平并觀察甲狀腺組織病理改變。
　　 Realtime PCR法檢測大鼠PBMCs中TNF-α、IL-10mRNA的表達(dá)情

6、況。
　　 結(jié)果:建模后模型組大鼠血清中的TGAb抗體水平明顯高于正常組(P＜0.01)，其甲狀腺組織亦發(fā)生明顯的炎癥反應(yīng)。模型組PBMCs中TNF-α mRNA表達(dá)水平升高，而IL-10mRNA的表達(dá)水平下降(P＜0.01)。經(jīng)環(huán)孢素A、依曲替酸、沙利度胺處理后EAT大鼠TGAb水平明顯降低(P＜0.01)，各治療組間也有顯著差異(P＜0.05)。在甲狀腺炎癥嚴(yán)重程度方面，各治療組與正常對照組及模型組相比較有顯著性差異(P＜0

7、.05)，而各治療組間無顯著差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:采用甲狀腺球蛋白、弗氏佐劑及高碘飲水免疫動(dòng)物，可成功建立EAT模型。EAT大鼠外周血中存在一定程度的Th1偏態(tài)性。環(huán)孢素A、依曲替酸及沙利度胺對EAT大鼠血清TGAb水平均有下調(diào)作用，以環(huán)孢素A最為明顯。EAT與銀屑病都屬于Th1型疾病，他們的若干免疫與細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)具有相似性，若干藥物療效及機(jī)理也具有一定相似性。因此，可以把EAT模型作為抗銀屑病藥物療效評(píng)價(jià)的活體模

8、型，并以環(huán)孢素A作為藥物治療效果的陽性對照，以TGAb水平作為判斷藥物是否起效的檢測指標(biāo)。
　　 第二部分抗銀屑病藥物對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎模型Th1/Th2平衡的調(diào)節(jié)機(jī)制研究
　　 目的:分析不同抗銀屑病藥物作用前后EAT大鼠PBMCs中Th1-Th2基因表達(dá)譜的差異性，尋找不同藥物調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡的相關(guān)基因并分析其可能機(jī)制。
　　 方法:將上述各組大鼠PBMCs分離后按組混合，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成

9、cRNA，與OligoGEArray(R) Th1-Th2-Th3基因芯片進(jìn)行雜交，Scan Array Scanner掃描儀進(jìn)行掃描，GEArray軟件分析，篩選出不同藥物治療前后表達(dá)有差異的基因并作分類分析。部分芯片結(jié)果用realtime PCR進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 結(jié)果:篩選出三個(gè)治療組共同表達(dá)基因，有4個(gè)基因(Ccr4、Ccr9、Gata3、Glmn)三組共同上調(diào)；有15個(gè)基因(CD4、Cxcr3、Cmkbr3、Fosl2、

10、Ifng、IL-18、Nfatc4、Socsl、Stat1、Tbx2l、Tnf、Tnfrsf4、Tnfsf4、Tnfsf5、Tnfsf6)共同下調(diào)。以realtime PCR驗(yàn)正TNF-α、IL-10、T-bet、Gata3 mRNA表達(dá)，與基因芯片結(jié)果吻合。
　　 結(jié)論:各抗銀屑病藥物均能通過上調(diào)Th2相關(guān)基因、下調(diào)Th1相關(guān)基因的表達(dá)以調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡。其中趨化因子及其受體，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以及腫瘤壞死因子及其受體超家族等

11、在基因芯片結(jié)果中有顯著變化，可能在銀屑病的免疫反應(yīng)中起著重要的作用。這些研究為深入研究銀屑病發(fā)生、發(fā)展、緩解機(jī)制，以及針對這些靶位進(jìn)行藥物研制開發(fā)提供了理論依據(jù)。
　　 第三部分腫瘤壞死因子/受體超家族在銀屑病發(fā)病中的作用探討
　　 目的:觀察銀屑病患者外周血及皮損中腫瘤壞死因子/受體超家族成員TNF-α、OX40、OX40L及HVEM的表達(dá)，探討其在銀屑病發(fā)病中的作用。
　　 方法:以正常人外周血及皮膚為對照，

12、realtime PCR檢測90例尋常型銀屑病患者外周血及20例患者皮損中TNF-α、OX40、OX40L及HVEM mRNA表達(dá)，免疫組化檢測皮損中OX40、OX40L蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:銀屑病患者皮損及外周血TNF-α mRNA水平增高(P＜0.05)，OX40 mRNA水平在皮損中增高(P＜0.05)，在外周血中無明顯差異(P＞0.05)，而OX40L mRNA水平在外周血及皮損中均降低(P＜0.05)，外周血及皮

13、損中HVEM mRNA表達(dá)與正常對照相比無顯著差異(P＞0.05)，皮損中OX40、OX40L蛋白表達(dá)均高于正常皮膚(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:腫瘤壞死因子/受體超家族成員TNF-α、OX40、OX40L等在銀屑病的Th1-Th2細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子的調(diào)整、CD4+T細(xì)胞的定向遷移等過程中發(fā)揮重要的作用，可望以此為靶位進(jìn)行免疫治療。實(shí)驗(yàn)中銀屑病患者外周血及皮損中OX40L mRNA水平降低，而HVEM mRNA水平與正常對照相