組織因子途徑抑制物2的減少對動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性影響的臨床及基礎研究.pdf

1、背景:
　　動脈粥樣硬化疾病已成為威脅國人健康的主要疾病之一，動脈粥樣硬化(atherosclerosis， AS)斑塊不穩(wěn)定是導致不穩(wěn)定性心絞痛，急性心肌梗死，心源性猝死等冠心病臨床急癥的根本原因。目前主要的假說認為發(fā)病時動脈粥樣硬化的斑塊發(fā)生破裂，暴露了內(nèi)膜下的致凝成分和脂質(zhì)核心，進而形成局部血栓導致冠脈急性供血不足，導致急性冠脈綜合征的發(fā)生。動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性主要決定于斑塊纖維帽的完整性，斑塊纖維帽的完整性則主要與細胞外

2、基質(zhì)(extracellar matrix， ECM)合成與降解的動態(tài)平衡有關(guān)?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是調(diào)控ECM合成與降解動態(tài)平衡的重要酶系，與粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定息息相關(guān)。
　　組織因子途徑抑制物2(tissue factor pathway inhibitor-2，TFPI-2)屬Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制物家族蛋白，主要分布于內(nèi)皮細胞和成纖維細胞的細胞外基質(zhì)(ECM)和胎盤合胞體滋養(yǎng)層中。TFPI-2為MMPs活性的

3、內(nèi)源性抑制物，在維持和調(diào)控細胞外基質(zhì)重塑方面，起到關(guān)鍵的作用。一方面TFPI-2可以先于其它蛋白酶抑制劑直接抑制MMP的活性;另一方面，通過抑制纖溶酶和胰蛋白酶，阻止ECM中的基質(zhì)金屬蛋白酶原(proMMPs)活化為MMPs，間接調(diào)控MMPs活性。
　　我們前期的臨床研究提示TFPI-2在急性冠脈綜合征患者外周血中水平較低，且在動物預實驗中發(fā)現(xiàn)易損斑塊肩部TFPI-2表達量低，并與MMPs呈負相關(guān)，我們推測TFPI-2的表達不足可

4、能是動脈粥樣硬化斑塊發(fā)生發(fā)展的病理生理基礎之一。以此為研究切入點，我們設計從臨床和基礎兩方面來探討TFPI-2水平減低和動脈粥樣斑塊穩(wěn)定性的關(guān)系，并試圖闡明其機制。
　　第一部分、組織因子途徑抑制物2基因多態(tài)性與急性冠脈綜合征關(guān)聯(lián)性的臨床研究
　　目的:在中國漢族人群中檢測TFPI-2基因是否存在基因多態(tài)性，并探討其與冠心病、急性冠脈綜合征的相關(guān)性。
　　方法:采用病例對照研究設計，選擇急性冠脈綜合征(acute co

5、ronary syndrome，ACS)患者140例，其中包括不穩(wěn)定型心絞痛患者(unstable angina，UA)68例、急性心肌梗死患者(acute myocardium infarction，AMI)72例;穩(wěn)定型心絞痛患者(stableangina，SA)273例，以及正常對照306例。采用聚合酶鏈反應產(chǎn)物直接測序的方法對所有納入對象進行TFPI-2基因多態(tài)性分析和關(guān)聯(lián)分析。采用SPSS19.0軟件統(tǒng)計分析結(jié)果。
　　

6、結(jié)果：本研究共入選719例，其中ACS組140例（包括不穩(wěn)定型心絞痛68例和急性心肌梗死72例）;穩(wěn)定型心絞痛組273例;正常對照組306例。在所有對象的TFPI-2基因中共檢測出8個單核苷酸多態(tài)性位點，分別是rs3763473，rs59805398, rs60215632, rs59999573, rs59740167, rs34489123, rs4517,rs4264。其中rs59805398位點C等位基因在ACS組與對照組間差異

7、有統(tǒng)計學意義(p=0.0001;p＜0.05);另外和rs34489123位點G等位基因在ACS組與對照組間差異有統(tǒng)計學意義(p=0.015; p＜0.05)。而SA組與對照組比較;rs59805398位點等位基因C的頻率組間差異有統(tǒng)計學意義(p=0.0001; p＜0.05)，rs34489123位點等位基因G的頻率組間差異有統(tǒng)計學意義(p=0.0001; p＜0.05)。rs3763473，rs59999573，rs59740167

8、，rs34489123四個位點在ACS組中存在連鎖不平衡，與rs59805398位點關(guān)聯(lián)分析提示主要有C-C-G-G-G和T-C-G-G-G兩種單倍型。rs59999573，rs59740167，rs34489123位點在SA組中存在連鎖不平衡，與rs59805398位點進行關(guān)聯(lián)分析，主要有C-G-G-G和G-A-A-A兩種單倍型。ACS組與SA組之間均未見明顯差異。
　　結(jié)論：本研究發(fā)現(xiàn)TFPI-2基因外顯子及兩端非編碼區(qū)存在8

9、個SNP位點，其中rs59805398位點等位基因C和rs34489123位點等位基因G與ACS和SA發(fā)病有密切關(guān)聯(lián)，是冠心病的發(fā)病可能的風險因子。
　　第二部分、下調(diào)組織因子途徑抑制物2對動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性影響的實驗研究
　　一、血管內(nèi)皮細胞條件性TFPI-2基因敲除小鼠模型的建立
　　目的：構(gòu)建血管內(nèi)皮細胞TFPI-2條件性基因敲除小鼠模型，為研究TFPI-2與動脈粥樣硬化的關(guān)系提供實驗模型。
　　方法：

10、通過組織特異性定點重組Cre/LoxP系統(tǒng)構(gòu)建血管內(nèi)皮細胞條件性TFPI-2敲除的小鼠模型，剪鼠尾抽提基因組，PCR法鑒定小鼠基因型。共得到TFPI-2-/+/Tek-cre小鼠6只作為實驗組，對照組為同背景C57小鼠、ApoE-/-小鼠各6只;三組小鼠每隔2周采血200ul離心分離血清測TFPI-2表達量，飼養(yǎng)至20周后處死取主動脈血管組織用western blot方法檢測血管TFPI-2表達量，驗證基因敲除效率。
　　結(jié)果：成

11、功制備血管內(nèi)皮條件性TFPI-2敲除的小鼠模型6只，基因型為TFPI-2fl/-/Tek，該組小鼠血清TFPI-2水平約300-400pg/ml左右，明顯低于C57BL/6J組和ApoE-/-組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，Western blot檢測血管TFPI-2表達水平，TFPI-2-/+組小鼠血管組織TFPI-2表達量較ApoE-/-組低，較C57組明顯減少;C57組小鼠血管TFPI-2水平高于ApoE-/-組。

12、　　結(jié)論：血管內(nèi)皮條件性TFPI-2基因敲除小鼠模型制備成功。
　　二、血管內(nèi)皮細胞條件性TFPI-2基因敲除對小鼠動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的影響
　　目的：采用高脂飲食飼養(yǎng)的方法誘導血管內(nèi)皮細胞TFPI-2條件性基因敲除小鼠發(fā)生動脈粥樣硬化，分析其動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性形態(tài)學指標的變化。
　　方法：將4-6周齡ApoE-/-小鼠、C57小鼠、TFPI-2fl/-/Tek小鼠各6只，分為三組，將上述模型利用高脂飲食飼養(yǎng)，

13、制備TFPI-2fl/-/Tek小鼠動脈粥樣硬化模型。20周齡后處死小鼠，截取主動脈斑塊組織切片，HE染色，彈力纖維染色檢測斑塊不穩(wěn)定性形態(tài)學指標，明確TFPI-2基因條件性敲除后對AS不穩(wěn)定斑塊的影響。
　　結(jié)果：三組小鼠體重未見明顯差異，20周ApoE-/-組小鼠、TFPI-2-/+組小鼠與C57BL6J組小鼠血脂比較，TFPI-2-/+組小鼠、C57BL6J組小鼠的TC，TG和LDL-C，HDL-C水平顯著低于ApoE-/-

14、組(p＜0.05);而TFPI-2-/+組小鼠與C57BL6J組比較，血脂水平未見明顯差異(p＞0.05)，動脈粥樣硬化模型造模成功。斑塊穩(wěn)定性分析提示:TFPI-2+/-組和ApoE-/-組在管腔表面積、斑塊表面積、脂質(zhì)核心表面積、纖維帽層數(shù)和斑塊破裂數(shù)量明顯高于C57BL/6J組(P＜0.05);而纖維帽厚度則低于C57BL/6J組(P＜0.05);同時，TFPI-2+/-組而較ApoE-/-組斑塊表面積、脂質(zhì)核心表面積、纖維帽層數(shù)

15、和斑塊破裂數(shù)量較低，纖維帽厚度略高(P＜0.05)，因此TFPI-2+/-組斑塊穩(wěn)定性比ApoE-/-組高，卻低于C57BL/6J組。
　　結(jié)論：與ApoE-/-組比較，下調(diào)血管內(nèi)皮細胞TFPI-2基因表達水平能夠增加動脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定性。
　　三、TFPI-2水平下調(diào)對小鼠動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定影響的機制初探
　　目的：血管內(nèi)皮細胞TFPI-2條件性基因敲除小鼠經(jīng)誘導后發(fā)生動脈粥樣硬化，其動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性

16、介于ApoE-/-小鼠與C57BL6J小鼠之間，通過免疫組化檢測斑塊MMPs表達量和TFPI-2水平，結(jié)合western blot，探討TFPI-2基因下調(diào)對斑塊不穩(wěn)定性的影響機制。
　　方法：利用上述分組動物的主動脈標本，通過免疫組化染色檢測MMPs家族（MMP-2，MMP-9）的表達水平;同時采用Westernblot檢測斑塊組織中3條與斑塊穩(wěn)定性密切相關(guān)的NF-κB、PPAR-γ及PI3Kγ/PKB通路激活水平。
　　

17、結(jié)果：TFPI-2-/+組的TFPI-2在AS斑塊中的平均光密度值為992±72，明顯低于ApoE-/-組1336±171和C57BL/6J組1609±210，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);ApoE-/-組TFPI-2水平低于C57BL/6J組，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);同時，TFPI-2-/+組的MMP-2在AS斑塊中的平均光密度值為13260±1844，明顯高于ApoE-/-組10385±1183和C57BL/6J組1008

18、7±1344(P＜0.05)，TFPI-2-/+組的MMP-9在AS斑塊中的平均光密度值為11098±1186，明顯高于ApoE-/-組9048±952和C57BL/6J組9184±1297(P＜0.05)。Western blot提示TFPI-2水平下調(diào)后，斑塊組織中PPAR-γ磷酸化水平較ApoE-/-組和C57BL/6J組明顯下降，而PI3Kγ/PKB、NF-κ B通路活性變化不明顯。提示TFPI-2水平的下調(diào)對PPAR-γ通路具