大腸桿菌DH5α upp基因的敲除及其應(yīng)用研究.pdf

1、反向篩選標(biāo)記指在一定的篩選條件下，含有標(biāo)記基因的菌株死亡，不含有篩選標(biāo)記基因的菌株反而能存活下來(lái)的標(biāo)記基因。這樣一來(lái)，既不引入抗性基因，又能到達(dá)篩選的目的。upp基因廣泛存在于原核生物和某些低等真核生物細(xì)胞中，其表達(dá)產(chǎn)物為尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（Uracil Phosphoribosyltransferase，UPRT）。UPRT能將5-氟尿嘧啶轉(zhuǎn)化成5-氟單磷酸脫氧尿嘧啶，從而抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。利用這一特性，u

2、pp基因可用來(lái)作為反向篩選篩標(biāo)記基因。本研究主要利用Red同源重組系統(tǒng)敲除大腸桿菌DH5α的upp基因，構(gòu)建得到重組菌DH5α-△upp。該重組菌可作為反向篩選標(biāo)記基因upp使用的宿主菌。
　　 敲除方案有兩種:一種是運(yùn)用PCR技術(shù)，擴(kuò)增出兩翼與upp基因上下游同源臂同源，中間為卡那霉素抗性基因的DNA片段。同源臂長(zhǎng)度為50 bp。經(jīng)電轉(zhuǎn)化，將外源DNA片段轉(zhuǎn)入含有質(zhì)粒pKD46的大腸桿菌DH5α中。在Red重組酶的作用下，外援

3、DNA片段與染色體上的同源區(qū)域發(fā)生重組，將upp基因置換，得到upp基因敲除缺陷菌株DH5α-△upp。另一種方法是用PCR的方法合成upp基因上游和下游的兩個(gè)同源臂序列，分別為853 bp和804 bp。再以上下游同源臂為模板重疊延伸合成線性DNA片段。將該片段電轉(zhuǎn)入含有質(zhì)粒pKD46的大腸桿菌DH5α，雙交換得到重組子。重組子的篩選利用upp基因作反向篩選。與野生型相比，upp基因敲除的突變株生長(zhǎng)速度略有變慢，但是對(duì)5-氟尿嘧啶的抗