遺傳性視網(wǎng)膜病變模式動物的的氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變觀察.pdf

1、視網(wǎng)膜新生血管性眼底病是一類常見的致盲性疾病，如早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈阻塞等均可因新生血管增生、牽拉而導(dǎo)致視網(wǎng)膜脫離。視網(wǎng)膜新生血管的發(fā)生原因至今仍不是十分清楚，是眼科關(guān)注的重點問題之一。視網(wǎng)膜缺血、缺氧是形成視網(wǎng)膜新生血管的重要原因，缺氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新生血管的生成是常用的復(fù)制視網(wǎng)膜新生血管性疾病，特別是研究早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變的常用方法[1，2]。但是缺氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜新生血管形成與所采用的動物品系有關(guān)。另外有文獻報道

2、[3]，視網(wǎng)膜色素變性患者及視網(wǎng)膜退行性變模式小鼠很少生成視網(wǎng)膜新生血管，為新生血管疾病的治療帶來了新的希望。早期的工作中,我們實驗室發(fā)現(xiàn)一種快速視網(wǎng)膜變性小鼠（Retinal degeneration fast，rdf）及兩種自發(fā)性基因突變模式大鼠，分別為先天性靜止性夜盲(congenital stationary night-blindness,CSNB)大鼠[4]和視網(wǎng)膜錐細胞失功能（retinal cone dystfuncti

3、on,RCD）大鼠[5]，其在成年時僅主要表現(xiàn)為功能性的改變，而視網(wǎng)膜光感受器則無明顯的退行性變化。為進一步探索視網(wǎng)膜新生血管的發(fā)生機制，我們參照文獻方法[6]，對新生的模式動物采用高濃度氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新生血管制備模型，觀察三種模式動物的視網(wǎng)膜新生血管發(fā)生特點。
　　材料和方法:
　　選擇清潔級、鼠齡為7d的SD大鼠、CSNB大鼠、RCD大鼠、rdf×C57BL/6J小鼠、rdf×C57BL/6J雜合子小鼠及rdf小鼠各1窩，

4、每窩(即每組)6只為高氧/復(fù)氧實驗組,正常對照組為以上6種品系同齡新生鼠各1窩每窩(即每組)6只。(正常SD大鼠由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心購買,突變品系動物由第四軍醫(yī)大學(xué)航空航天醫(yī)學(xué)系屏障動物實驗室提供)。將實驗組新生鼠與母鼠共同置于密閉的動物實驗氧艙（DWC450-1150型，上海七〇一所楊園醫(yī)用氧艙廠）。氧艙內(nèi)接入濕化醫(yī)用純氧,氧氣的流量控制在0.5-0.75L/min,使氧艙內(nèi)氧濃度保持在80％±2％,氧艙內(nèi)氣壓保持為常壓。用數(shù)字

5、測氧儀(Ceramatec公司生產(chǎn)的Maxo2 Oxygen Analyzer,ModelOM225AE)測量艙內(nèi)的氧濃度,氧濃度穩(wěn)定后每間隔2h監(jiān)測1次,使其始終保持在80％±2％。每天打開氧艙更換墊料、加水、添食1次。在此環(huán)境中飼養(yǎng)5d,然后回到正常氧環(huán)境下繼續(xù)飼養(yǎng)5d至第17d。正常對照組新生鼠與母鼠飼養(yǎng)于正常氧環(huán)境至第17d。
　　按Browning等[7]報道的墨汁灌注顯色法，各組新生鼠在P18時進行視網(wǎng)膜鋪片，即在鐘形

6、罩下乙醚吸入深度麻醉，心臟灌注生理鹽水及4％多聚甲醛各10ml后，灌注墨汁與明膠水溶液（1：50）混合液，比例為1：2，每只新生鼠灌注3ml，而后迅速取出雙側(cè)眼球，固定于4％多聚甲醛中24h，將其中1只眼球在解剖顯微鏡下去除角膜、晶狀體、玻璃體和鞏膜。完整剝離視網(wǎng)膜組織，以視乳頭為中心做4個放射狀切開，將視網(wǎng)膜平鋪于掛膠載玻片上，50％甘油封片后在光鏡下觀察視網(wǎng)膜新生血管發(fā)生情況。
　　取另1只眼放入4％多聚甲醛溶液中4℃固定24

7、h后，去除前節(jié)，制作成眼杯。酒精常規(guī)梯度脫水、石蠟包埋，切片方向平行于角膜至視乳頭的矢狀位連續(xù)4μm切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下對視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞核進行計數(shù)。每只眼球取20張切片，相鄰兩張間隔30μm，用雙盲法計數(shù)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞數(shù)，統(tǒng)計每只眼球每張切片突破內(nèi)界膜的內(nèi)皮細胞核數(shù)。選取切片時應(yīng)避開視乳頭周圍，僅計數(shù)與內(nèi)界膜有聯(lián)系的血管內(nèi)皮細胞核數(shù)[9]。
　　各組新生小鼠按以上大鼠做視網(wǎng)膜組織切片的方法一眼做視網(wǎng)膜組

8、織切片，另一眼用免疫組織化學(xué)方法，以v-WF因子染色識別血管內(nèi)皮細胞。（所用一抗、二抗由美國sigma公司提供。）血管內(nèi)皮細胞胞漿中見棕黃色為陽性。
　　結(jié)果:
　　在正常飼養(yǎng)環(huán)境下，RCD大鼠視網(wǎng)膜血管網(wǎng)稀疏，SD大鼠視網(wǎng)膜切片偶見內(nèi)皮細胞。在高氧/復(fù)氧誘導(dǎo)下，各實驗組新生鼠視網(wǎng)膜血管正常放射狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)受到破壞，結(jié)構(gòu)稀疏，血管迂曲、收縮或擴張，部分血管出現(xiàn)閉塞，可見無灌注區(qū)。其中SD大鼠、CSNB大鼠視網(wǎng)膜有出血點，甚至片

9、狀出血。組織切片顯示除對照組的SD大鼠中偶見突破內(nèi)界膜的內(nèi)皮細胞核外，其他5組均未見。實驗組中SD大鼠、CSNB大鼠、RCD大鼠、rdf×C57BL/6J小鼠、rdf×C57BL/6J雜合子小鼠和rdf小鼠6種品系中均可見較多的突破內(nèi)界膜內(nèi)皮細胞核，計數(shù)結(jié)果分別為24.10±2.49，38.20±10.47，68.00±3.06，16.95±5.12，25.52±6.90，29.15±23.79，與同品系的對照組有顯著性的差異（P<0.