含功能基肽核酸單體的合成.pdf

1、1991年，哥本哈根大學的Riso實驗室的Nielsen等人以酰胺鍵連接的N-(2-氨乙基)甘氨酸骨架單位代替了核酸中磷酸二酯鍵連接的核糖-磷酸骨架單位，設計合成了肽核酸(簡稱PNA)。 在PNA分子中，天然核酸堿基通過亞甲基羰基連在骨架甘氨酸的氮原子上，形成了類似多肽骨架的核酸分子。PNA的空間結構是DNA和RNA非常好的模擬物，保留了與互補DNA或RNA及PNA之間以堿基配對原則結合的能力，而且這種結合遵從Waston-Cr

2、ick氫鍵結合的原則。PNA/DNA和PNA/RNA的復合物要比相應的DNA/DNA和RNA/RNA穩(wěn)定得多。由同聚嘧啶PNA和同聚嘌呤DNA形成的(PNA)2/DNA則具有更高的穩(wěn)定性。而且，PNA與DNA和RNA之間的雜交熱穩(wěn)定性有以下特點：(1)PNA-DNA雜交不受離子強度的影響；(2)PNA-PNA>PNA-RNA>PNA-DNA>DNA-DNA。而聚酰胺的骨架特點使PNA可以采用經(jīng)典的Fmoc/tBu或Boc/Bzl固相多肽

3、合成策略制備，操作簡單、費用低、效率高，并可適當放大量制備。與DNA或RNA相比，PNA具有更好的化學和生物學穩(wěn)定性，不易被核酸酶和蛋白酶降解；PNA結構中無電負性磷酸二酯鍵的連接橋而呈電中性，避免了與血漿相互作用，從而降低了其非特異性作用發(fā)生的可能。 但是，由于PNA自身電中性骨架的結構特點，使其在水溶性和生物學利用度等方面表現(xiàn)較差，并且具有自聚傾向，這些缺點是目前其在應用領域的主要障礙。 迄今已有多種對PNA骨架和堿

4、基的修飾，其主要目的是改善經(jīng)典PNA的水溶性，增強雜交親和力和序列選擇性，提高生物利用度，拓展PNA在分子生物學領域的應用。對PNA單體的結構改造與修飾主要分為以下幾個部分：(1)骨架的修飾；(2)堿基的修飾；(3)骨架和堿基同時修飾。 骨架的修飾：對PNA單體的骨架修飾的方式是多種多樣的，概括起來主要有以下幾種：(1)單體兩端化學活性位點(N端和C端)修飾；(2)改變單體從N端到C端之間的鍵數(shù)，即改變骨架長度；(3)用手性氨基

5、酸代替甘氨酸在α位引進修飾基團；(4)用手性氨基酸在γ位引進修飾基團；(5)在單體N端和C端之間引入環(huán)狀結構。 堿基的修飾：主要是在堿基上的某些位點進行修飾或者用其它含氮基團代替核酸堿基。因為所改造的PNA序列將用于形成高級結構，因此對單體的改造必須不影響堿基間氫鍵的形成。(1)脲嘧啶的5位引入官能團，因為這個位點不參與氫鍵的形成，不會引入大的立體化學障礙。(2)引入偽胞嘧啶，2，6-二氨基嘌呤等天然堿基的類似物。(3)胸腺嘧啶

6、和胞嘧啶雜環(huán)化修飾。(4)引入能夠進行熒光標記的堿基。骨架和堿基同時修飾：目前，大多是在骨架或堿基上分別對PNA單體進行修飾，同時進行修飾的單體尚未見報道。堿基和骨架同時進行修飾，要充分考慮保護基的正交性原則，以利于肽核酸的序列合成。除了考慮氨基的保護外，還要考慮氨基酸側鏈的保護；在堿基上引入保護基時，也要充分考慮到與骨架上氨基保護基和氨基酸側鏈保護基之間的正交保護問題。 2002年，ISIS公司購買了PNA的相關專利，準備將其

7、發(fā)展為第三代反義寡聚核苷酸，這標志著PNA成為藥物的前景已逐漸被看好。肽核酸能與DNA和RNA特異性結合及化學和生物學穩(wěn)定性等特性使其在分子生物學領域得到了廣泛的應用，也帶動與之相關的化學、分子生物學和生物技術領域的發(fā)展。 目的：由于經(jīng)典肽核酸自身功能基較少，缺乏參與生物和化學活性的官能團，結合課題組進行的利用PNA高級結構，進行結構與功能關系的探索研究的需要，本課題從堿基和骨架兩方面引入功能基。 (1)利用尿嘧啶的5位

8、引入羧甲基官能團； (2)將骨架中的甘氨酸以絲氨酸或天冬氨酸代替，在骨架中引入羧基和羥基。 方法：在PNA序列的固相合成中采用了Boc/Bzl保護策略，要求單體的羧基部分游離，氨基采用叔丁氧羰基加以保護。為滿足固相合成的需要以及單體合成過程中保護基的穩(wěn)定，在骨架和堿基的合成中采用了相應的保護基團。對于骨架，以臨時性保護基叔丁氧羰基和烯丙基分別保護骨架兩端的氨基和羧基，以半永久性基團芐基保護骨架中氨基酸側鏈基團；對于堿基部

9、分，采用半永久性保護基苯甲?；推S基，分別保護腺嘌呤的環(huán)外氨基和5-羧甲基尿嘧啶的羧基；這些半永久性保護基確保了這些引入功能基在單體的合成和序列合成過程中的穩(wěn)定性。最后這些半永久性保護基經(jīng)氟化氫裂解全部脫除。 結果：結合文獻，按照設計的路線完成了反應。 (1)N-(2-叔丁氧羰基氨基乙基)-N-[5-(芐氧羰基乙基)尿嘧啶-1-乙酰基]-O-芐基-L-絲氨酸。 (2)N-(2-叔丁氧羰基氨基乙基)-N-[5-(芐

10、氧羰基乙基)尿嘧啶-1-乙?；鵠-β-O-芐酯-L-天冬氨酸。 結論： 1.在合成過程中，采用了合適的正交保護策略。 2.中間體(3)合成中，通過降低反應溫度和苯甲酰氯的滴加速度，減少副產物。 3.由于中間體(7)溶解性較差，采用一般的酯化方法收率較低。而采用縮合劑酯化的方法收率較高。 4.中間體(8)與溴乙酸叔丁酯反應時，1位和3位氮上的氫都會被取代，降低反應溫度可以減少3位氮上氫被取代的情況。