白色念珠菌H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶N端肽段的原核表達及應(yīng)用.pdf

1、近年來，隨著大量免疫抑制劑、化療藥物和廣譜抗生素的廣泛應(yīng)用，侵襲性念珠菌感染（invasive candidiasis，IC）的發(fā)病率和死亡率不斷上升。但因缺乏特異的臨床癥狀，且血培養(yǎng)和組織病理學檢查這兩種確診方法缺乏敏感性，往往延誤治療，因此亟需更快速、敏感的方法用于IC的診斷。國內(nèi)外學者已經(jīng)把注意力集中于用血清學方法檢測患者血液中的白念珠菌特異性抗原、抗體及代謝產(chǎn)物上。研究表明白色念珠菌H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶是IC血清學診斷中的一個候選

2、抗原。
　　目的：
　　原核表達白色念珠菌H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶N末端肽段(N-terminal region of histone3 lysine4 methyltransferase，Set1-208p)，建立檢測人血清中抗Set1-208p IgG類抗體的ELISA方法，評估其在IC中的早期診斷價值。
　　方法：
　　對GenBank報道的白色念珠菌H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶（histone3 lysine4methy

3、ltransferase，Set1p）與其他物種H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶進行序列比對，選擇與人類無同源性的抗原特異性片段，設(shè)計一對引物，以白色念珠菌C1標準株基因組DNA為模板，PCR擴增Set1-208p的編碼基因，以pET28a(+)為載體，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)獲得重組菌，并用IPTG誘導重組蛋白質(zhì)表達，Talon金屬親和柱層析純化后用抗his標簽的單克隆抗體進行鑒定。純化的Set1-208p一方面用于免疫家兔

4、，制備多克隆抗體。另一方面用于建立檢測人血清中相應(yīng)IgG類抗體的ELISA方法，并評估其在家兔感染模型以及IC患者中早期診斷價值。
　　結(jié)果：
　　成功克隆了白色念珠菌抗原特異性H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶片段Set1-208p基因，制備了相應(yīng)的工程菌株，誘導表達并獲得了純化的重組肽段，所得蛋白約為29kDa，帶有His標簽，經(jīng)western blot鑒定表明誘導的重組蛋白可與IC病人血清發(fā)生特異性反應(yīng);制備了針對白色念珠菌Set1-

5、208p的兔抗血清，western blot結(jié)果顯示特異性良好;建立了檢測抗白色念珠菌抗Set1-208p抗體的ELISA方法，以該法檢測兔模型血清，在感染第4天開始抗體陽性，病人血清檢測結(jié)果顯示，該方法對IC的診斷敏感性為79.2％，特異性為90％，且與細菌感染及其他真菌感染病人（如曲霉）無非特異交叉反應(yīng)。
　　結(jié)論：
　　成功表達了白色念珠菌H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶N末端肽段Set1-208p重組蛋白質(zhì)，建立了檢測抗Set1-