甲狀腺乳頭狀腺癌中ARHI E2F1和STAT3的表達(dá)及其意義.pdf

1、背景:甲狀腺腫瘤是人類頭頸部疾病中的常見病和多發(fā)病,而甲狀腺乳頭狀腺癌是甲狀腺腫瘤中最常見的惡性腫瘤,占相當(dāng)大的比例。但我們對(duì)其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制知之甚少。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素的生物學(xué)行為,因此探索不同基因在甲狀腺乳頭狀癌中表達(dá)作用情況,有助于我們更好的了解其發(fā)生機(jī)制及指導(dǎo)臨床治療。
　　 ARHI是YU等用差異顯示PCR的方法。從人卵巢和乳腺上皮細(xì)胞及其癌細(xì)胞中克隆出一種新的候選抑癌基因。YU等研究發(fā)現(xiàn)ARHI抑制G1期

2、cyclin-CDK的活性使細(xì)胞不能通過(guò)G1期,防止細(xì)胞過(guò)度增殖,大量研究表明,與正常乳腺上皮組織和卵巢上皮組織相比,ARHI在乳腺癌和卵巢癌中缺失或低表達(dá),表明ARHI是腫瘤抑制基因。Lu Z等在卵巢癌細(xì)胞系SKOv3中,用EMSA(電泳遷移率實(shí)驗(yàn))方法,發(fā)現(xiàn)ARHI啟動(dòng)子區(qū)域(-385到-409)有E2F1的結(jié)合位點(diǎn),并且癌細(xì)胞中E2F的結(jié)合活性增強(qiáng),E2F1負(fù)性調(diào)節(jié)ARHI啟動(dòng)子活性。而Nishimoto等人通過(guò)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)和免

3、疫共沉淀法發(fā)現(xiàn)STAT3與ARHI相互作用,形成復(fù)合體,阻止了IL-6介導(dǎo)的STAT3進(jìn)入細(xì)胞核,從而降低了STAT3與DNA的結(jié)合和STAT3依賴的啟動(dòng)子活性。
　　 目的:本實(shí)驗(yàn)采用病理形態(tài)學(xué)觀察和免疫組織化學(xué)研究甲狀腺乳頭狀癌中ARHI、E2F1、STAT3蛋白水平的表達(dá)情況。同時(shí)應(yīng)用RT-PCR方法,研究甲狀腺乳頭狀腺癌中ARHI基因mRNA水平表達(dá)情況。以期探討ARHI、E2F1、STAT3在甲狀腺乳頭狀腺癌中的表達(dá)變

4、化規(guī)律和可能的調(diào)控機(jī)制,及它們之間是否具有相關(guān)性,并初步闡明三者蛋白表達(dá)在甲狀腺乳頭狀腺癌發(fā)生中的可能作用。
　　 方法:
　　 1研究對(duì)象
　　 選取河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院病理科2000年12月至2010年1月期間存檔蠟塊,所有病例診斷明確,臨床資料完整,包括88例甲狀腺乳頭狀腺癌、22例甲狀腺腺瘤、15例甲狀腺濾泡癌、12例甲狀腺髓樣癌、8例甲狀腺未分化癌,同時(shí)選取20例正常甲狀腺組織,用于各指標(biāo)蛋白的免疫組織

5、化檢測(cè)。收集河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院2009年3月-2009年8月間甲狀腺腫瘤手術(shù)切除標(biāo)本共15例,臨床資料完整,手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí),包括甲狀腺乳頭狀腺癌11例,髓樣癌2例,結(jié)節(jié)性甲狀腺腫1例,橋本氏甲狀腺炎1例。因?yàn)樗铇影?結(jié)節(jié)性甲狀腺腫,橋本氏甲狀腺炎例數(shù)太少,所以僅選取11例甲狀腺乳頭狀腺癌來(lái)研究,另取正常甲狀腺組織10例作為對(duì)照,用于檢測(cè)ARHI基因mRNA表達(dá)情況。所有的新鮮組織保存在-80℃冰箱中備用。
　　 2免疫組

6、織化學(xué)方法
　　 采用免疫組織化學(xué)SP兩步法,研究ARHI、E2F1、STAT3蛋白表達(dá)情況。具體操作按照免疫組織化學(xué)試劑盒進(jìn)行。蘇木素復(fù)染,乙醇梯度脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,光鏡觀察。
　　 3反轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)檢測(cè)mRNA的表達(dá)
　　 3.1細(xì)胞總RNA的提取、鑒定及定量
　　 采用異硫氰酸胍一步法提取細(xì)胞總RNA。1％瓊脂糖電泳鑒定其完整性。
　　 3.2 RT-PCR方法

7、
　　 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,建立PCR反應(yīng)體系,94℃變性5min,94℃50s,62℃30s,72℃30s,30次循環(huán)擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物于1.5％瓊脂糖凝膠中電泳(90V,35min)。紫外分析儀觀察并照相。
　　 4統(tǒng)計(jì)分析
　　 所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì),X2檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)分析。
　　 結(jié)果:
　　 1 ARHI蛋白在甲狀腺乳頭狀腺癌中的表達(dá)情況
　　 88例

8、甲狀腺乳頭狀腺癌ARHI蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為65.91％(58/88),15例甲狀腺濾泡癌中ARHI蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為66.67％(10/15),統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,甲狀腺乳頭狀腺癌和濾泡癌中ARHI蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常甲狀腺組織(P＜0.05),另外,甲狀腺乳頭狀腺癌中ARHI蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于甲狀腺腺瘤、甲狀腺髓樣癌和甲狀腺未分化癌(P＜0.05)。甲狀腺乳頭狀腺癌和濾泡癌之間,甲狀腺腺瘤、髓樣癌、未分化癌和正常甲狀腺組織之間A

9、RHI蛋白陽(yáng)性表達(dá)率差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 2 E2F1蛋白在甲狀腺乳頭狀腺癌中的表達(dá)情況
　　 甲狀腺乳頭狀腺癌中E2F1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為70.45％(62/88);正常甲狀腺組織、甲狀腺腺瘤、甲狀腺濾泡癌、甲狀腺髓樣癌、甲狀腺未分化癌中E2F1的陽(yáng)性表達(dá)率分別為O％(0/20)、31.82％(7/22)、80％(12/15)、83.33％(10/12)、50％(4/8)。經(jīng)卡方檢驗(yàn),甲狀腺乳頭狀腺

10、癌中E2F1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常甲狀腺組織和甲狀腺腺瘤(P＜0.05)。甲狀腺腺瘤、濾泡癌、髓樣癌和未分化癌中E2F1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常甲狀腺(0％),差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均是P＜0.05)。甲狀腺乳頭狀腺癌與甲狀腺濾泡癌、髓樣癌和未分化癌之間E2F1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義中(P＞0.05)。
　　 3 STAT3蛋白在甲狀腺乳頭狀腺癌中的表達(dá)情況
　　 甲狀腺乳頭狀腺癌中STAT3蛋白的陽(yáng)性表

11、達(dá)率為79.55％(70/88)。正常甲狀腺組織、甲狀腺腺瘤、甲狀腺濾泡癌、甲狀腺髓樣癌和甲狀腺未分化癌中STAT3蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為35％(7/22)、72.73％(16/22)、86.67％(13/15)、100％(12/12)、87.5％(7/8)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,甲狀腺乳頭狀腺癌中STAT3蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常甲狀腺組織(P＜0.05)。甲狀腺乳頭狀腺癌與甲狀腺腺瘤、濾泡癌、腺髓樣癌和未分化癌之間STAT3蛋白的陽(yáng)性表

12、達(dá)率差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。甲狀腺濾泡癌、甲狀腺髓樣癌、甲狀腺未分化癌中STAT3蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常甲狀腺組織(P＜0.05)。
　　 4 ARHI、E2F1、STAT3在不同病例中表達(dá)情況的相關(guān)性研究
　　 在甲狀腺乳頭狀腺癌中,相關(guān)分析提示ARHI蛋白表達(dá)與E2F1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.238,P=0.026)。在正常甲狀腺組織、甲狀腺腺瘤、甲狀腺濾泡癌、甲狀腺髓樣癌和甲狀腺未分化癌中,A

13、RHI、E2F1、STAT3之間無(wú)相關(guān)關(guān)系。
　　 5 ARHI、E2F1、STAT3蛋白在甲狀腺乳頭狀腺癌中表達(dá)的臨床病理意義
　　 經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn),在本研究中,ARHI、E2F1和STAT3蛋白表達(dá)與甲狀腺乳頭狀腺癌的發(fā)病年齡、性別和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)相關(guān)關(guān)系。
　　 6 ARHI基因mRNA在甲狀腺乳頭狀腺癌和正常甲狀腺組織中表達(dá)情況RT-PCR結(jié)果,10例正常甲狀腺組織和11例甲狀腺乳頭狀腺癌中,分別有7例和

14、8例可以檢測(cè)到ARHImRNA表達(dá),陽(yáng)性表達(dá)率分別為70％,72.73％。經(jīng)x2檢驗(yàn),正常甲狀腺組織和甲狀腺乳頭狀腺癌中ARHI基因mRNA陽(yáng)性表達(dá)率差別無(wú)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1印跡抑癌基因ARHI蛋白在正常甲狀腺組織中低表達(dá),而在甲狀腺乳頭狀腺癌和濾泡癌中高表達(dá),在甲狀腺髓樣癌和未分化癌中低表達(dá),但在甲狀腺乳頭狀腺癌中mRNA水平未見明顯變化,提示ARHI作用可能存在組織差異,其蛋白

15、高表達(dá)可能在促進(jìn)甲狀腺乳頭狀腺癌和濾泡癌發(fā)生中發(fā)揮一定作用。
　　 2與ARHI不同,不同類型甲狀腺癌中E2F1和STAT3蛋白表達(dá)水平都明顯高于正常甲狀腺組織,提示E2F1和STAT3蛋白高表達(dá)促進(jìn)了不同類型甲狀腺癌的發(fā)生。
　　 3在甲狀腺乳頭狀腺癌中,E2F1與ARHI之間存在正相關(guān)關(guān)系,E2F1正性調(diào)節(jié)ARHI蛋白的表達(dá)。
　　 4 ARHI、E2F1和STAT3蛋白表達(dá)與甲狀腺乳頭狀腺癌的發(fā)病年齡、性別