涎腺腺樣囊性癌中低氧與自噬相關(guān)基因的生物信息學(xué)研究.pdf

1、生物信息學(xué)是一門(mén)交叉學(xué)科，是結(jié)合數(shù)學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)、工程學(xué)來(lái)處理生物學(xué)數(shù)據(jù)、研究生物學(xué)問(wèn)題的新興學(xué)科，現(xiàn)已在分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。生物信息學(xué)在醫(yī)學(xué)生物學(xué)中最廣泛的應(yīng)用之一，就是在分析基因和蛋白表達(dá)、功能注釋以及調(diào)控機(jī)制的研究中，起到非常積極的作用;在遺傳學(xué)及基因組學(xué)領(lǐng)域，生物信息學(xué)技術(shù)可以幫助人們?cè)跍y(cè)序和注釋基因組，以及和基因組相關(guān)的可變剪切、突變等方面獲得更多信息;生物信息學(xué)圖形技術(shù)，例如圖像及信號(hào)處理技術(shù)，允許科

2、研人員從大量原始數(shù)據(jù)中提取有用的結(jié)果;在文本挖掘生物學(xué)文獻(xiàn)、生物學(xué)數(shù)據(jù)查詢(xún)中，生物信息學(xué)同樣扮演重要角色。
　　目前生物信息學(xué)幾個(gè)重要的研究方面，包括表觀遺傳組學(xué)、基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等，在腫瘤研究中都有廣泛的應(yīng)用。其中，代表基因表達(dá)數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)是應(yīng)用的最為廣泛的一個(gè)方向。包含有數(shù)萬(wàn)個(gè)基因表達(dá)情況的的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，反映了細(xì)胞或組織即刻的生理病理狀態(tài)，同時(shí)反映了這一過(guò)程中基因的活動(dòng)信息;通過(guò)對(duì)比不同條件或不同組織來(lái)

3、源的基因表達(dá)情況，可以反應(yīng)內(nèi)在的基因?qū)用娴穆?lián)系，在尋找生物標(biāo)志物，探究疾病機(jī)制機(jī)理、評(píng)價(jià)藥物及其他治療手段效果等方面都有重要作用。目前，基因芯片是生物醫(yī)學(xué)研究中最常用的高通量基因檢測(cè)的手段之一。
　　基因芯片，是微觀DNA點(diǎn)粘附在固體表面的集合，用芯片同時(shí)檢測(cè)大量基因表達(dá)水平或基因組多個(gè)區(qū)域的基因型。由于芯片包含數(shù)以萬(wàn)計(jì)的探針，基因芯片實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛲瓿稍S多并行基因測(cè)試，在生物醫(yī)學(xué)研究中，一方面可以通過(guò)運(yùn)用基因芯片，研究各類(lèi)疾病發(fā)生發(fā)展

4、的內(nèi)部機(jī)制，建立調(diào)控網(wǎng)絡(luò);另一方面也可以應(yīng)用于尋找疾病的標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，因此基因芯片技術(shù)極大地加速了很多疾病的研究。在現(xiàn)有的腫瘤研究，如肺癌、胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、頭頸鱗癌等各類(lèi)癌癥的研究中，基因芯片的應(yīng)用非常廣泛，然而，在涎腺腺樣囊性癌中，基因芯片的應(yīng)用相對(duì)較少。
　　腺樣囊性癌是一種較為少見(jiàn)的惡性腫瘤，可發(fā)生在身體的許多部位，最常發(fā)生在頭頸部，尤其是涎腺，相對(duì)于粘液表皮樣癌、多形性腺瘤，腺樣囊性癌是最常見(jiàn)的涎腺惡性腫瘤

5、之一。腺樣囊性癌易復(fù)發(fā)，易遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，同時(shí)早期即有侵犯神經(jīng)等較為獨(dú)特的生物學(xué)行為，目前主要的治療手段是手術(shù)聯(lián)合放化療的綜合治療，接受手術(shù)的原發(fā)腺樣囊性癌病例的五年、十年、十五年、二十年、二十五年的生存率分別為77.3％，59.6％，44.9％，35.0％，25.5％，總體療效仍然不能令人滿(mǎn)意。近年來(lái)，隨著生物醫(yī)學(xué)研究的逐步深入，人們對(duì)于腺樣囊性癌的發(fā)生發(fā)展的研究取得了很大的進(jìn)展。許多原癌基因、抑癌基因被發(fā)現(xiàn)參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，與此

6、同時(shí)，也有很多生物學(xué)信號(hào)通路被發(fā)現(xiàn)在涎腺腺樣囊性癌中過(guò)度的活躍或抑制，如mTOR信號(hào)通路、NOTCH1信號(hào)通路、p53信號(hào)通路等等。
　　自噬是在組織微環(huán)境較為惡劣的情況下，細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)成分通過(guò)溶酶體被降解，在自噬溶酶體中，待降解物質(zhì)在各種酶和蛋白的作用下，分解成氨基酸和核苷酸等，通過(guò)三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生可以被重新利用的小分子，是細(xì)胞內(nèi)的一種自我保護(hù)機(jī)制。在生物進(jìn)化過(guò)程中，自噬這一生物學(xué)過(guò)程非常保守，廣泛的存在于真核細(xì)胞的胚胎發(fā)育、炎

7、癥、氧化應(yīng)激、低氧、缺血等各種生理或病理過(guò)程中。自噬與腫瘤的關(guān)系同樣是自噬研究中的一個(gè)熱點(diǎn)問(wèn)題，現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，自噬可能參與到了腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等眾多環(huán)節(jié)。而在自噬的啟動(dòng)方面，低氧是報(bào)道最多的環(huán)境因素。
　　低氧作為腫瘤發(fā)展過(guò)程中不可避免的微環(huán)境之一，對(duì)腫瘤的進(jìn)展起到了非常重要的作用。在低氧條件下，腫瘤細(xì)胞通過(guò)改變某些調(diào)控因子和蛋白，激活特定的信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)活動(dòng)，這其中就包括自噬。很多學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在腫瘤中低

8、氧可以誘導(dǎo)自噬，上調(diào)自噬水平，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生存，同時(shí)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)，在結(jié)腸癌、胃癌、前列腺癌中，都有大量關(guān)于低氧誘導(dǎo)自噬的相關(guān)報(bào)道。在這一過(guò)程中，低氧誘導(dǎo)因子1α作為細(xì)胞應(yīng)對(duì)低氧微環(huán)境的重要轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)對(duì)靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控進(jìn)而調(diào)控相應(yīng)蛋白的表達(dá)，在調(diào)節(jié)低氧誘導(dǎo)的自噬中起重要作用。因此在低氧誘導(dǎo)自噬這一生物信號(hào)通路中，低氧誘導(dǎo)因子1α的表達(dá)與自噬基因的關(guān)系，很大程度上反應(yīng)了低氧與自噬的內(nèi)在聯(lián)系，是研究低氧自噬的關(guān)鍵。我們課題組前期

9、實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)低氧自噬相關(guān)基因在涎腺腺樣囊性癌中表達(dá)活躍，與腫瘤的生存及轉(zhuǎn)移有一定的相關(guān)性。然而，涎腺腺樣囊性癌中，用生物信息學(xué)技術(shù)在基因整體表達(dá)水平上對(duì)低氧自噬的分析尚未有相關(guān)報(bào)道。
　　目的:
　　在我們課題組的前期研究中，自噬信號(hào)通路與涎腺腺樣囊性癌的預(yù)后有顯著的相關(guān)性，因此在本研究中，我們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)手段，重點(diǎn)研究自噬這一信號(hào)通路在涎腺腺樣囊性癌中的表達(dá)情況，并分析自噬信號(hào)通路在基因水平上的富集情

10、況，探索在涎腺腺樣囊性癌低氧自噬中，低氧誘導(dǎo)因子1α與自噬相關(guān)基因的關(guān)系，以期對(duì)其在涎腺腺樣囊性癌中的作用及調(diào)節(jié)機(jī)制有更深入的研究。
　　方法:
　　1.從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)篩選、下載并預(yù)處理相關(guān)數(shù)據(jù)集，獲得涎腺腺樣囊性癌的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。
　　2.應(yīng)用R語(yǔ)言，Wilcoxon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行差異表達(dá)基因分析。
　　3.進(jìn)行文獻(xiàn)檢索，收集整理自噬相關(guān)基因。
　　4.應(yīng)用超幾何分布檢驗(yàn)進(jìn)行自噬通路的富集分析。
　　

11、5.對(duì)低氧誘導(dǎo)因子1α基因與自噬基因進(jìn)行相關(guān)分析，并選擇有正相關(guān)性的一個(gè)自噬基因作為靶基因，作為下一步的研究對(duì)象。
　　6.應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法檢驗(yàn)涎腺腺樣囊性癌組織中低氧誘導(dǎo)因子1α基因與靶基因?qū)?yīng)的蛋白表達(dá)情況。
　　7.應(yīng)用二氯化鈷在細(xì)胞系A(chǔ)CC-M中構(gòu)建低氧模型，通過(guò)免疫熒光技術(shù)，檢測(cè)是否有自噬的產(chǎn)生。
　　8.應(yīng)用二氯化鈷在細(xì)胞系A(chǔ)CC-M中構(gòu)建低氧模型，作用0小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)后，應(yīng)用RT-

12、PCR技術(shù)，Western blot技術(shù)檢測(cè)低氧誘導(dǎo)因子1α基因與靶基因的表達(dá)是否具有一致性。
　　結(jié)果:
　　1.在數(shù)據(jù)集GSE59701中，共有20201個(gè)基因的表達(dá)值，以表達(dá)值差異超過(guò)2倍或者小于0.5倍，P值小于0.05為篩選條件，共篩選出764個(gè)上調(diào)基因，占總基因數(shù)的3.78％;545個(gè)下調(diào)基因，占總基因數(shù)的2.70％。
　　2.根據(jù)文獻(xiàn)收集整理出26個(gè)自噬相關(guān)基因。
　　3.在上調(diào)表達(dá)基因中，以P值小

13、于0.05為篩選條件，對(duì)以上26個(gè)自噬相關(guān)基因簇進(jìn)行富集分析，P值等于0.008223，判定該通路上調(diào);在下調(diào)表達(dá)基因中，對(duì)以上26個(gè)自噬相關(guān)基因簇進(jìn)行富集分析，P值等于0.446729，無(wú)法判定該通路為下調(diào)。
　　4.采用了Spearman相關(guān)系數(shù)，P值小于0.05為篩選條件，有五個(gè)基因ATG3、ATG4A、ATG5、PIK3R4和MAP1LC3B與低氧誘導(dǎo)因子1α基因的表達(dá)顯著正相關(guān)。
　　5.選擇MAP1LC3B為靶基

14、因。71例涎腺腺樣囊性癌患者的腫瘤組織切片中，進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，53例可以觀察到低氧誘導(dǎo)因子1α表達(dá)陽(yáng)性，40例可以觀察到MAP1LC3B對(duì)應(yīng)蛋白表達(dá)陽(yáng)性，25例患者中，低氧誘導(dǎo)因子1α與MAP1LC3B對(duì)應(yīng)蛋白同時(shí)表達(dá)陽(yáng)性。
　　6.選取200μ mol/L的二氯化鈷為作用濃度，對(duì)ACC-M細(xì)胞作用24小時(shí)后，通過(guò)免疫熒光技術(shù)檢測(cè)證實(shí)，可以誘導(dǎo)ACC-M細(xì)胞株中自噬體的產(chǎn)生。
　　7.選取200μ mol/L的二氯化鈷

15、為作用濃度，對(duì)ACC-M細(xì)胞作用0小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)后，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)與Western blot檢測(cè)證實(shí)，低氧誘導(dǎo)因子1α與基因MAP1LC3B在基因水平和蛋白水平中表達(dá)一致性上調(diào)。
　　結(jié)論:
　　本研究顯示，涎腺腺樣囊性癌中自噬信號(hào)通路在基因水平上明顯上調(diào)，低氧誘導(dǎo)因子1α基因與ATG3、ATG4A、ATG5、PIK3R4和MAP1LC3B五個(gè)基因自噬基因的表達(dá)有正相關(guān)性，表達(dá)趨勢(shì)一致。經(jīng)臨床及細(xì)胞學(xué)