羽毛降解菌枯草芽孢桿菌B-3的分離鑒定及角蛋白酶基因的克隆表達(dá).pdf

1、角蛋白酶( keratinase)是一種能特異降解角蛋白的蛋白酶。近年來(lái)隨著角蛋白酶在去垢劑的制造、皮革加工、食品工業(yè)和飼料生產(chǎn)中廣泛的應(yīng)用而日益受到人們的青睞。本文以四川農(nóng)業(yè)大學(xué)養(yǎng)雞場(chǎng)堆砌廢棄羽毛處采集的土壤為樣品，篩選出一株可以利用羽毛并能高效降解羽毛粉的枯草芽孢桿菌，并克隆了其kerC基因和實(shí)現(xiàn)了該基因在大腸桿菌中融合表達(dá)。
　　 1.從四川農(nóng)業(yè)大學(xué)養(yǎng)雞場(chǎng)長(zhǎng)期堆砌廢棄羽毛處采集的土壤中篩選出了具有降解角蛋白能力的7株細(xì)菌。

2、對(duì)其中產(chǎn)角蛋白酶酶活的最高的B-3菌株進(jìn)行了形態(tài)觀察、生理生化特性以及系統(tǒng)發(fā)育樹分析，鑒定B-3為枯草芽孢桿菌，該菌發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶酶活力可達(dá)2.261U/mL。
　　 2.利用PCR技術(shù)克隆了編碼枯草芽孢桿菌B-3的角蛋白酶基因。該基因序列全長(zhǎng)1146bp，編碼381個(gè)氨基酸，含信號(hào)肽序列。與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)該基因與數(shù)據(jù)庫(kù)中來(lái)自枯草芽孢桿菌YYW-1的kerC基因(GenBank No.: EU362730)相似

3、性達(dá)到100％。蛋白結(jié)構(gòu)域分析顯示，kerC含兩個(gè)絲氨酸蛋白酶家族的保守結(jié)構(gòu)域，屬于絲氨酸蛋白酶家族成員。
　　 3.以克隆的枯草芽孢桿菌B-3角蛋白酶基因?yàn)榛A(chǔ)，利用大腸桿菌表達(dá)載體pET-32a(+)構(gòu)建kerC原核表達(dá)載體pET-kerC，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果表明，該酶在大腸桿菌中獲得了高效表達(dá)，在重組菌細(xì)胞裂解上清液中檢測(cè)到角蛋白酶活性，酶活力可達(dá)14.814U/mL，比活力可達(dá)0.0852 I