乳腺癌細(xì)胞分泌的VEGF誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫功能抑制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:
　　隨著惡性腫瘤發(fā)病率的逐漸升高，腫瘤己成為威脅人類(lèi)健康和生命最主要的疾病之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)報(bào)告預(yù)測(cè)，2015年美國(guó)將有1，658，370例新發(fā)癌癥病例，并有589，430例死亡病例。近年來(lái)，中國(guó)的乳腺癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。在女性腫瘤患者中，乳腺癌的發(fā)病率居所有腫瘤發(fā)病率的第1位，死亡率為第2位。乳腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟、多因素的過(guò)程，它受到腫瘤本身和宿主免疫功能等因素的影響。近年來(lái)，隨著對(duì)乳腺癌研究的深入，人們?cè)絹?lái)

2、越認(rèn)識(shí)到宿主的免疫功能在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。乳腺癌細(xì)胞通過(guò)分泌VEGF、PGE2和TGF-β等因子和誘導(dǎo)正常宿主細(xì)胞完成免疫抑制功能，故許多腫瘤患者存在免疫功能低下。在被誘導(dǎo)的正常宿主細(xì)胞中，血管內(nèi)皮細(xì)胞不僅是血管與周?chē)M織間的物理屏障，還可分泌免疫調(diào)節(jié)因子，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，因此被認(rèn)為與腫瘤細(xì)胞所誘導(dǎo)的免疫抑制有關(guān)，但其具體機(jī)制目前尚不清楚。本研究通過(guò)研究人和小鼠的乳腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞所分泌免疫因子的變化，旨在探

3、討乳腺癌細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的誘導(dǎo)作用和免疫抑制作用及其可能的機(jī)制。
　　研究方法:
　　乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)培養(yǎng)24h，收集其培養(yǎng)上清離心后備用。血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)生長(zhǎng)至70～80％融合后，分別給予1640培養(yǎng)基、VEGF及MCF-7的培養(yǎng)上清和SU5416+MCF-7的培養(yǎng)上清進(jìn)行刺激24h，隨后換用1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，收集其上

4、清液（條件培養(yǎng)基），一部分用ELISA法測(cè)定血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)、IL-6和IL-12，另一部分刺激外周血T細(xì)胞后，進(jìn)行CCK-8、ELISPOT及流式細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)。30只6～8周齡的雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分成3組，分別行第4對(duì)乳腺注射PBS、注射4T1細(xì)胞和注射4T1細(xì)胞+Celecoxib灌胃，作

5、為PBS組(n=10)、4T1組(n=10)及TC組(n=10)，建立小鼠乳腺癌模型。所有小鼠眼球摘除法取血，離心后收集血清，應(yīng)用ELISA法分別測(cè)定PBS組、4T1組和TC組的白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)和白介素-12(IL-12)。PBS組和4T1組的肺組織一部分以(q)RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)測(cè)定環(huán)氧合酶-2(COX-2)的表達(dá)水平，另一部分分離小鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞(Mouse pulmona

6、ry vascular endothelial cell，MPVEC)并培養(yǎng)，用ELISA法測(cè)定培養(yǎng)上清中PGE2的表達(dá)水平。
　　研究結(jié)果:
　　1.乳腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫抑制因子分泌增加
　　ELISA實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)24h培養(yǎng)上清刺激后，血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)24h培養(yǎng)上清（T-sup組）中VEGF、PGE2和IL-6表達(dá)水平較Media組明顯升高。
　　2.乳腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)血

7、管內(nèi)皮細(xì)胞免疫增強(qiáng)因子分泌減少
　　ELISA實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)MCF-7細(xì)胞24h培養(yǎng)上清刺激后，HUVEC細(xì)胞24h培養(yǎng)上清（T-sup組）中IL-12表達(dá)水平較Media組明顯降低。
　　3.乳腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)T淋巴細(xì)胞凋亡
　　CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組比較，以MCF-7細(xì)胞誘導(dǎo)后HUVEC細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理T細(xì)胞，24h的0.D.值無(wú)明顯差異，48h的0.D.值降低，表明T細(xì)胞凋亡增加。
　　4

8、.乳腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制T淋巴細(xì)胞免疫功能
　　ELISPOT結(jié)果顯示，以MCF-7細(xì)胞誘導(dǎo)后HUVEC細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理PBMC（主要為T(mén)淋巴細(xì)胞），T淋巴細(xì)胞IFN-γ的表達(dá)水平降低。
　　5.乳腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制CD8+T細(xì)胞活化
　　流式細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示，以MCF-7細(xì)胞誘導(dǎo)后HUVEC細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理T細(xì)胞24h，IFN-γ染色陽(yáng)性的CD8+T細(xì)胞比例較對(duì)照組減少，而IFN-γ染色陽(yáng)性的CD

9、4+T細(xì)胞比例較對(duì)照組無(wú)明顯差異。
　　6.荷瘤小鼠血液中免疫抑制因子含量增加
　　ELISA結(jié)果顯示，4T1組與PBS組相比，免疫抑制因子IL-6和IL-10的含量升高。
　　7.荷瘤小鼠血液中免疫增強(qiáng)因子含量減少
　　ELISA結(jié)果顯示，4T1組與PBS組相比，免疫增強(qiáng)因子IL-12含量降低。
　　8.乳腺癌細(xì)胞分泌的VEGF在血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌免疫因子中的作用
　　ELISA實(shí)驗(yàn)表明，MCF-72

10、4h培養(yǎng)上清中VEGF水平較HUVEC中明顯升高。VEGF組中VEGF、PGE2和IL-6水平較對(duì)照組升高，IL-12水平降低，加入VEGF受體拮抗劑SU5416后，各因子的表達(dá)水平與對(duì)照組無(wú)明顯差異。
　　9.荷瘤小鼠肺組織中COX-2和PGE2表達(dá)上調(diào)
　　(q)RT-PCR和Western blot顯示，COX-2在4T1組的表達(dá)均較PBS組上調(diào)。分離的4T1組MPVEC24h培養(yǎng)上清中，PGE2的水平也較PBS組的表

11、達(dá)水平高。
　　10.Celecoxib拮抗乳腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的免疫抑制作用
　　ELISA結(jié)果顯示，TC組小鼠給予Celecoxib治療后，與4T1組相比，血清中免疫抑制因子IL-6和IL-10的含量降低，IL-12含量升高，與PBS組相比無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論:
　　1.乳腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫功能抑制。
　　2.乳腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫功能抑制可能與VEGF誘導(dǎo)PGE2表達(dá)增