大腸癌DNA甲基化相關(guān)蛋白UHRF1、UHRF2及miR-149的臨床意義及其影響大腸癌生物學(xué)行為的機(jī)制研究.pdf

1、目的：檢測(cè)含PHD及指環(huán)結(jié)構(gòu)域的類(lèi)泛素蛋白1(ubiquitin-like,containing PHD and RING finger domains,UHRF1)及UHRF2的表達(dá)水平與大腸癌臨床病理特征及患者預(yù)后的相關(guān)性;探討UHRF1及UHRF2影響大腸癌生物學(xué)行為的作用機(jī)制;篩選大腸癌中甲基化敏感的microRNA(miRNA)分子,明確其與大腸癌臨床病理特征及大腸癌患者預(yù)后的聯(lián)系,并闡明miRNA通過(guò)下游靶基因影響大腸癌生物

2、學(xué)行為的作用機(jī)制。
　　方法：(1)免疫組織化學(xué)檢測(cè)175例大腸癌及癌旁組織中UHRF1的表達(dá)水平,與大腸癌臨床病理特征及患者生存期做關(guān)聯(lián)性分析:qRT-PCR檢測(cè)20例大腸癌及癌旁組織、4個(gè)大腸癌細(xì)胞株及1個(gè)正常腸道上皮細(xì)胞株中UHRF1的表達(dá)水平;構(gòu)建UHRF1的干擾siRNA載體并轉(zhuǎn)染大腸癌細(xì)胞DLD-1及SW620:MTT檢測(cè)干擾UHRF1表達(dá)前后細(xì)胞增殖活力的變化,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期的變化,Transwe

3、ll實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力的變化。(2)免疫組織化學(xué)檢測(cè)175例大腸癌及癌旁組織中UHRF2的表達(dá)水平,與大腸癌臨床病理特征及患者生存期做關(guān)聯(lián)性分析。生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)UHRF2上游可能調(diào)控其表達(dá)的miRNA分子,熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miRNA對(duì)UHRF2的調(diào)控,qRT-PCR及Westem blot在20例大腸癌及癌旁組織、4個(gè)大腸癌細(xì)胞株及1個(gè)正常腸道上皮細(xì)胞株中驗(yàn)證miRNA與UHRF2 mRNA及蛋白水平的相關(guān)性;構(gòu)建miRNA的

4、類(lèi)似物(miRNA mimics)及UHRF2的干擾siRNA序列并轉(zhuǎn)染大腸癌DLD-1細(xì)胞;MTT、流式細(xì)胞儀及transwell實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)上調(diào)miRNA及干擾UHRF1表達(dá)前后細(xì)胞增殖活力,細(xì)胞周期及細(xì)胞侵襲能力的變化;構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型,瘤內(nèi)注射mimics上調(diào)miRNA表達(dá)水平,觀察注射期間瘤體大小變化,qRT-PCR及Western blot檢測(cè)UHRF2 mRNA及蛋白水平變化,免疫組化檢測(cè)UHRF2及增殖相關(guān)蛋白PC

5、NA表達(dá)水平變化。(3)miRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)DNMTs抑制劑5-氮-2’-脫氧胞苷(5-aza-dc,DAC)處理前后的大腸癌細(xì)胞株LoVo、SW480及HT29,大腸癌HCT116及其DNMTs基因敲除型細(xì)胞DKOHCT116,以及正常腸上皮細(xì)胞株NCM460中的miRNA表達(dá)水平,篩選出大腸癌中甲基化敏感的miRNA,并行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qRT-PCR)驗(yàn)證;查找miRN

6、A轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游CpG島,亞硫酸氫鹽測(cè)序(Bisulfitesequencmg PCR,BSP)及甲基特異性PCR(Methylation-specific PCR,MSP)檢測(cè)正常腸道上皮、大腸腺瘤、大腸癌細(xì)胞及組織中CpG島的甲基化狀態(tài),并與miRNA的表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析;qRT-PCR及免疫組織化學(xué)分別檢測(cè)臨床大腸癌組織中miRNA及靶基因的表達(dá)水平,與相應(yīng)大腸癌患者的臨床病理特征及生存期隨訪信息做相關(guān)性分析;改變大腸癌細(xì)胞中

7、miRNA的表達(dá)水平,MTT實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)miRNA水平變化前后細(xì)胞在增殖活力及侵襲能力方面的變化;基因芯片檢測(cè)miRNA水平變化前后大腸癌細(xì)胞中基因水平的變化,結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測(cè)篩選miRNA的下游靶基因,qRT-PCR及Western blot驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果,熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證miRNA與靶基因的結(jié)合位點(diǎn);在臨床大腸癌組織中檢測(cè)靶基因表達(dá)情況,并與miRNA表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析;對(duì)轉(zhuǎn)染了Spl過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及對(duì)照

8、質(zhì)粒的大腸癌SW480細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-149類(lèi)似物或其對(duì)照序列,隨后通過(guò)MTT及Transwell實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)處理前后細(xì)胞在增殖及轉(zhuǎn)移能力方面的變化。
　　結(jié)果：(1)UHRF1在大腸癌組織中表達(dá)增加;UHRF1蛋白表達(dá)水平與組織學(xué)分級(jí)(P=0.011)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.006)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.042)、和較低的Dukes分期(P=0.004)相關(guān);UHRF1陽(yáng)性表達(dá)大腸癌患者的生存時(shí)間短于陰性表達(dá)者,兩者差異具有邊

9、緣顯著性(P=0.078);下調(diào)UHRF1顯著抑制了大腸癌細(xì)胞的遷移能力,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,并阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期;大腸癌組織中UHRFI的表達(dá)與p16ink4a的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P=0.003),下調(diào)UHRF1顯著增加了P16INK4A的表達(dá)。(2)UHRF2在大腸癌組織中表達(dá)增加;UHRF2的陽(yáng)性表達(dá)與浸潤(rùn)深度(P＜0.001)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(p=0.003)和較低的Dukes分期(P=0.005)相關(guān);UHRF2陽(yáng)性表達(dá)大腸癌患者的

10、生存時(shí)間明顯短于陰性表達(dá)者(P=0.017):let-7a作為UHRF2上游調(diào)節(jié)miRNA,可以通過(guò)下調(diào)UHRF2的表達(dá)抑制大腸癌細(xì)胞增殖活力和侵襲能力、阻滯細(xì)胞于G0/G1期:瘤內(nèi)注射let-7a下調(diào)了UHRF2的表達(dá),并抑制了裸鼠皮下移植瘤的增殖。(3)miR-149在DAC處理后及DNMTs敲除型細(xì)胞株中表達(dá)上調(diào),其在大腸癌細(xì)胞株的表達(dá)也低于正常腸上皮細(xì)胞株,miR-149轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)附近存在甲基化的CpG島,而逆轉(zhuǎn)其甲基化可以上調(diào)

11、miR-149的表達(dá);在正常腸道上皮、大腸腺瘤及大腸癌組織中,CpG島的甲基化狀態(tài)呈遞增的趨勢(shì),且與miR-149的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān);大腸癌組織中低表達(dá)miR-149與腫瘤浸潤(rùn)加深(P=0012),及較短的生存期相關(guān)(P=0.025);上調(diào)大腸細(xì)胞株SW480及HT29中miR-149的表達(dá)后,細(xì)胞增殖活力下降,細(xì)胞侵襲及遷移能力減弱;Sp1在上調(diào)miR-149后的SW480細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)合qRT-PCR、Wester

12、n blot及熒光素酶報(bào)告基因證明了miR-149對(duì)Sp1的負(fù)調(diào)控作用,Sp1蛋白在大腸癌組織中表達(dá)上調(diào),且與miR-149呈負(fù)相關(guān);轉(zhuǎn)染miR-149類(lèi)似物逆轉(zhuǎn)了Sp1過(guò)表達(dá)引起的SW480細(xì)胞增殖。
　　結(jié)論：(1)甲基化相關(guān)蛋白UHRF1及UHRF2在大腸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,可作為大腸癌的診斷及預(yù)后監(jiān)測(cè)指標(biāo)。(2)下調(diào)UHRF1可抑制大腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移,且該作用與p16 INK4A相關(guān)。(3)let-7a可通過(guò)抑制