肝癌的血清蛋白質(zhì)組分析——Fibulin-1是肝癌轉(zhuǎn)移的潛在血清標(biāo)志物.pdf

1、研究背景：
　　 肝細(xì)胞癌(以下簡稱肝癌)是常見的消化道惡性腫瘤，是世界上腫瘤致死率最高的惡性腫瘤之一。由于肝癌起病隱匿、早期診斷困難、發(fā)生發(fā)展迅速等原因，很多患者在就診時已處于腫瘤的中晚期，即使是接受了手術(shù)和/或放療、化療，預(yù)后依然很差。雖然隨著現(xiàn)代對腫瘤基礎(chǔ)研究的深入、影像學(xué)檢查技術(shù)的不斷進(jìn)步、新抗癌藥物的開發(fā)及多種輔助診療手段的出現(xiàn)，人類對肝癌的認(rèn)識和診治已經(jīng)取得了長足進(jìn)步，但是肝癌患者的總體預(yù)后情況仍沒有得到明顯的改善。

2、影響肝癌患者預(yù)后的重要因素，就是肝癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。
　　 在肝癌的診斷方面，目前應(yīng)用較多的早期診斷和篩查指標(biāo)仍舊是血清中的甲胎蛋白(AFP)檢測。雖然AFP對肝癌的早期診斷具有很重要的意義，然而它卻不能很好地用于預(yù)測肝癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。迄今為止，還沒有靈敏的、特異的血清學(xué)指標(biāo)，可用于評價肝癌的預(yù)后，也沒有找到能準(zhǔn)確預(yù)測肝癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的腫瘤標(biāo)志物。因此，要想改善肝癌的治療效果，改善肝癌患者的預(yù)后，就必須找到快捷、可靠、靈敏、特異的生

3、物學(xué)標(biāo)志物，從而做到及早治療肝癌和選擇最合適的治療方式。
　　 血液中富含多種的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)幾乎來自于人體內(nèi)的各種組織、細(xì)胞，甚至來自腫瘤、炎性組織形成、細(xì)菌和病毒感染等。因此，血液中蛋白質(zhì)的變化可以反映出人體在各種生理和病理狀態(tài)下的變化情況。再加上血液樣本的獲取方便、檢測快捷，因此是臨床上用于疾病診斷、病情監(jiān)控和預(yù)后判斷的重要檢測對象。蛋白質(zhì)組學(xué)，是對一個細(xì)胞、組織或個體某一時空表達(dá)的全部蛋白質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)研究的科學(xué)。近年來

4、，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究技術(shù)發(fā)展迅速，并已被研究者廣泛應(yīng)用于篩選腫瘤相關(guān)的蛋白質(zhì)分子的研究中，發(fā)現(xiàn)了大量傳統(tǒng)手段無法檢測到的新型腫瘤標(biāo)志物，提高了人們對腫瘤的認(rèn)識和臨床診治的水平。
　　 本研究通過雙向電泳(2-DE)聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解吸離子化-串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF MS)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，對肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和未轉(zhuǎn)移肝癌患者以及正常人的血清進(jìn)行分析，鑒定出肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和未轉(zhuǎn)移肝癌患者血清中表達(dá)有差異的蛋白質(zhì)，并篩選可能

5、作為肝癌轉(zhuǎn)移的血清學(xué)標(biāo)志物。進(jìn)一步，本研究對篩選出來的可能作為診斷肝癌轉(zhuǎn)移的血清學(xué)標(biāo)志物進(jìn)行了大樣本量的臨床與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以明確該蛋白用于早期診斷肝癌轉(zhuǎn)移的可行性。
　　 目的：
　　 1.建立和優(yōu)化肝癌患者血清的雙向電泳(2-DE)體系，為篩檢肝癌患者血清轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白奠定基礎(chǔ)。
　　 2.運(yùn)用優(yōu)化的后的技術(shù)，分析肝內(nèi)未轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)移肝癌患者血清蛋白質(zhì)組的表達(dá)差異。
　　 3.篩選可作為肝癌轉(zhuǎn)移診斷或預(yù)后判斷的

6、潛在標(biāo)志物。
　　 研究方法：
　　 1.病例收集：收集正常健康對照、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移肝癌和未轉(zhuǎn)移患者血清，肝癌組織樣本；乙肝、乙肝肝硬化患者血清，胃癌患者血清，結(jié)腸癌患者血清，食管癌患者血清樣本。并整理患者的病例資料。
　　 2.優(yōu)化血清雙向電泳的方法：取HCC患者血清，首先使用不同濃度ACN預(yù)處理，然后去除白蛋白和免疫球蛋白等高豐度蛋白質(zhì)，再進(jìn)行雙向電泳(2-DE)分析，檢測不同濃度ACN預(yù)處理后蛋白質(zhì)的檢測數(shù)量差異

7、。
　　 3.肝癌血清蛋白質(zhì)組分析：取正常對照、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和未轉(zhuǎn)移肝癌患者的血清各12例，進(jìn)行優(yōu)化后的2-D DIGE分析和MS分析，尋找表達(dá)有顯著性差異的蛋白質(zhì)，篩選可能作為肝癌血清標(biāo)志物的蛋白質(zhì)。
　　 4.標(biāo)志物的篩選和驗(yàn)證：在收集的所有血清和組織樣本中，用western blot、免疫組織化學(xué)、RT-PCR等方法驗(yàn)證篩選的潛在標(biāo)志物的有效性和特異性。
　　 5.通過ELISA方法，確定正常人、肝癌患者、其他

8、腫瘤及乙肝、肝硬化臟疾病患者血清中該標(biāo)志物表達(dá)水平，并統(tǒng)計分析計算ROC的工作點(diǎn)，并構(gòu)建ROC曲線；計算ROC曲線下面積及其標(biāo)準(zhǔn)誤，并進(jìn)行統(tǒng)計校驗(yàn)以判斷潛在標(biāo)志物診斷價值的大小。
　　 結(jié)果：
　　 1.共收集正常健康對照血清100例，有效的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移肝癌和未轉(zhuǎn)移患者血清各50例，肝癌組織標(biāo)本24例；乙肝、乙肝肝硬化患者血清各20例，胃癌患者血清16例，結(jié)腸癌患者血清11例，膽管癌患者血清4例。整理了完整的患者病例資料信息

9、。
　　 2.血清經(jīng)0％、20％和30％濃度的ACN預(yù)處理后，進(jìn)行2-DE分析發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的檢出數(shù)量分別為532±96、623±102和674±123，乙腈預(yù)處理能有效增加蛋白質(zhì)的檢測數(shù)量。
　　 3.正常對照、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和未轉(zhuǎn)移肝癌患者的血清各12例，經(jīng)過2-D DIGE和MS分析發(fā)現(xiàn)，與肝內(nèi)未轉(zhuǎn)移肝癌患者和正常成人血清相比，肝內(nèi)轉(zhuǎn)移肝癌患者血清中有17種蛋白質(zhì)有顯著性表達(dá)差異，其中有fibulin-1等4個蛋白質(zhì)表達(dá)

10、上調(diào)，K10等13個蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)。
　　 4.以fibulin-1為研究對象，經(jīng)western blot和免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在肝轉(zhuǎn)移肝癌患者的血清和組織中，fibulin-1的表達(dá)量都有顯著性升高。
　　 5.通過酵母表達(dá)fibulin-1蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品，利用間接ELISA方法測定fibulin-1在正常人、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移肝癌患者及未轉(zhuǎn)移患者、其他消化道腫瘤、乙肝、肝硬化患者血清中fibulin-1的含量，并進(jìn)行統(tǒng)計校驗(yàn)