不同藥用輔料對(duì)人α-防御素5多肽抗菌活性的影響研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　1975年，瑞典科學(xué)家G.Boman等用陰溝通桿菌及大腸桿菌誘導(dǎo)惜古比天蠶蛹，在天蠶蛹的血淋巴中分離得到一種物質(zhì)，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)這種物質(zhì)是一種具有殺菌作用的多肽，被命名為天蠶素(Cecropins)，這是世界上發(fā)現(xiàn)的第一種抗菌肽。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的抗菌肽有很多種，這些抗菌肽由基因編碼，存在于不同物種和各種組織內(nèi)。人源性抗菌肽數(shù)量相對(duì)較少，目前得到驗(yàn)證的人源性抗菌肽主要有防御素(defensins)家族、組織蛋白酶抑制

2、素(cathelicidins)家族、富含組氨酸蛋白家族(histatins)和富含甘氨酸的可能抗菌肽(hGlyrichi)家族。
　　防御素是人們?cè)谘芯坎溉閯?dòng)物、昆蟲等防御和抵抗病原微生物侵襲及感染的過程中發(fā)現(xiàn)的一種陽離子多肽。來源于人體的防御素根據(jù)半胱氨酸殘基的位置及二硫鍵的連接方式的不同，可分為a和β防御素兩類，其中a防御素有6種，分別是由中性粒細(xì)胞分泌的4種髓源性防御素（Humanneutrophilα-defensinH

3、NP1-4，HNP1-4）和由小腸潘氏細(xì)胞分泌的2種腸源性防御素(Humanα-defensin5and6，HD5、HD6)。防御素本身具有識(shí)別病原微生物與機(jī)體正常細(xì)胞的能力，所以在有效劑量范圍內(nèi)不會(huì)對(duì)人體正常細(xì)胞造成損傷，同時(shí)不會(huì)誘發(fā)產(chǎn)生耐藥。因此，防御素有望成為一種新型的抗生素。HD5主要由腸道上皮細(xì)胞和生殖道黏膜上皮細(xì)胞分泌表達(dá)，具有突出的抗菌和抗HIV、HPV和HSV-2等病毒的作用，是目前已知的人α防御素中抗菌譜最廣和抗菌活性

4、最突出的一種，具有很高的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。
　　藥用輔料是藥品中除主要活性成分外所有物質(zhì)的總稱，是藥物制劑的基礎(chǔ)材料。作為藥品制劑的重要組成部分，在制劑成形中起著關(guān)鍵作用。優(yōu)良的輔料可以使藥物生成需要的劑型，可以使藥物療效及生物利用度提高，還可降低其毒副作用。目前輔料種類有40多類共計(jì)上千種，包括防腐劑、賦形劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑、溶劑等。因此，選用正確的輔料是藥品安全性的根本保障，必須避開輔料的副反應(yīng)及了解其安全劑量。為了保持多肽及蛋

5、白質(zhì)藥物在制備及儲(chǔ)存過程中的生物活性，通常需要添加一些藥用輔料，包括醇類（甘露醇、甘油、山梨糖醇）、糖類（乳糖、蔗糖、葡萄糖）及氨基酸類（甘氨酸）等。已知，大多數(shù)防御素的抗菌活性受外界環(huán)境因素影響較大，為了尋找HD5多肽合適的輔料，本研究擬通過體外抗菌實(shí)驗(yàn)，藥物抗菌活性穩(wěn)定性試驗(yàn)，以抑菌率為響應(yīng)值，檢測(cè)分析常用多肽類藥物輔料對(duì)HD5抗菌活性及其穩(wěn)定性的影響，選取HD5的最佳輔料組合;同時(shí)，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分析含有輔料的HD5多肽對(duì)創(chuàng)面感染的

6、防治作用，從而為將HD5制成外用噴霧劑和HD5基因工程多肽藥物的研制奠定基礎(chǔ)。
　　研究方法:
　　1.查閱文獻(xiàn)，根據(jù)HD5的理化性質(zhì)及噴霧劑相關(guān)制劑要求篩選HD5的可能備選輔料，并通過相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)比及《中華人民共和國藥典》（2010年版）、《中國藥用輔料》相關(guān)要求設(shè)定輔料的濃度范圍。
　　2.逐一將備選輔料配制成一定范圍內(nèi)的相應(yīng)濃度，通過體外抗菌實(shí)驗(yàn)分析他們對(duì)HD5多肽抗菌活性的影響。以抑菌率作為響應(yīng)值，初步篩選出備選

7、輔料種類及濃度范圍。
　　3.將通過上一步檢測(cè)的相應(yīng)濃度的各種備選輔料以各種組合方式與HD5組成各種制劑，同時(shí)設(shè)置相應(yīng)單純輔料組合為對(duì)照，通過體外抗菌實(shí)驗(yàn)分析各輔料組合對(duì)HD5抗菌活性的影響。結(jié)合抗菌活性研究結(jié)果，確定其最佳輔料組合，然后將單純HD5及含該輔料組合的HD5制劑于37℃分別放置1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月、4個(gè)月、5個(gè)月、6個(gè)月，再次分析HD5的體外抗菌活。
　　4.建立動(dòng)物（小鼠）綠膿桿菌創(chuàng)面感染模型，觀察應(yīng)用HD

8、5+輔料制劑對(duì)動(dòng)物創(chuàng)面感染的防治情況，為今后HD5多肽的推廣應(yīng)用提供可靠實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.獲得HD5的可能輔料及大概濃度范圍，即在分別單獨(dú)加入濃度低于5％的甘油、12％的蔗糖、0.2％的吐溫-80、5％的HP-β-CD（Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin，羥丙基-β-環(huán)糊精）和0.05％的尼泊金甲酯鈉均沒有顯著影響HD5的抗菌活性。
　　2.初步獲得了HD5的相對(duì)最佳的輔料組合，

9、即5％甘油+2.5％HP-β-CD，通過相應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析該輔料組合可能對(duì)HD5的抗菌活性沒有影響，同時(shí)通過藥物加速試驗(yàn)得到該組合能夠在設(shè)定的時(shí)間范圍內(nèi)使HD5的活性保持相對(duì)穩(wěn)定。
　　3.建立了小鼠的背部皮膚綠膿桿菌感染模型，并初步證實(shí)5％甘油+2.5％-HP-β-CD+HD5可控制綠膿桿菌引發(fā)的創(chuàng)口感染，延緩病程，其作用和環(huán)丙沙星軟膏療效一樣。但HD5不會(huì)誘導(dǎo)綠膿桿菌產(chǎn)生耐藥性，這個(gè)特點(diǎn)使得HD5具有很好的開發(fā)前景。
　　

10、4.通過測(cè)量痂下細(xì)菌量初步評(píng)估了動(dòng)物綠膿桿菌感染狀況，為準(zhǔn)確判斷藥物對(duì)感染的控制情況提供了依據(jù)。
　　結(jié)論:
　　1.本研究利用體外抗菌實(shí)驗(yàn)初步測(cè)試了HD5的幾種常用藥用輔料及其大致濃度范圍，獲得了HD5的相對(duì)最佳的輔料組合;
　　2.本研究初步建立了一種HD5多肽藥物配方選擇的研究方法，數(shù)據(jù)可為建立一種HD5的外用噴霧劑配方提供參考;
　　3.建立了小鼠背部皮膚綠膿桿菌感染模型，并根據(jù)痂下細(xì)菌量初步判斷感染控制