特異性基因改變的人非小細(xì)胞肺癌原代動(dòng)物模型構(gòu)建及藥物效果評(píng)價(jià).pdf

1、第一章人非小細(xì)胞肺癌EGFRL858R+V834L基因突變?cè)鷦?dòng)物模型構(gòu)建與藥物效果評(píng)價(jià)
　　目的:非小細(xì)胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)是嚴(yán)重威脅人類健康的一類癌癥。近年來(lái)，靶向藥物治療成為NSCLC治療的重要手段。表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)是一種酪氨酸激酶(tyrosinekinase，TK)受體，在腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和分化過程中

2、發(fā)揮重要作用。EGFR在肺癌、乳腺癌等多種腫瘤中過表達(dá)，過表達(dá)與其基因突變密切相關(guān)。EGFR基因突變存在于一部分NSCLC患者，以吉非替尼為代表的EGFR酪氨酸激酶抑制劑對(duì)這一部分患者具有良好的治療效果。目前發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)多位于EGFR基因外顯子19和21，多數(shù)研究關(guān)注單點(diǎn)突變，且多以細(xì)胞為研究模型，不能準(zhǔn)確模擬在體環(huán)境。本研究首次建立EGFR蛋白L858R+V834L雙突變位點(diǎn)的皮下移植瘤小鼠模型，并觀察吉非替尼在這一模型中的治療效應(yīng)

3、。
　　方法:腫瘤標(biāo)本來(lái)源于湖南省長(zhǎng)沙市中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院手術(shù)患者，女性，54歲，中-低分化腺癌?；蚍中痛_定其EGFRL858R+V834L雙基因突變陽(yáng)性。原代腫瘤組織被剪成1.0～1.5mm3大小。雌性SCID小鼠背部皮下選取四個(gè)點(diǎn)接種瘤塊，每點(diǎn)兩塊，此為第一代荷瘤小鼠(P1)。當(dāng)某一點(diǎn)的皮下移植瘤直徑大于1cm時(shí)，處理小鼠，剝離腫瘤按上述方法接種第二批SCID小鼠(P2)，并重復(fù)上述步驟進(jìn)行腫瘤傳代，建立第三代、第四代荷瘤小

4、鼠。四代小鼠腫瘤組織以EGFR基因突變L858R特異性抗體，采用免疫組織化學(xué)法和免疫印跡方法檢測(cè)EGFR表達(dá)。DNA從腫瘤組織獲得經(jīng)PCR后產(chǎn)物送測(cè)序。第三代小鼠接種后，當(dāng)瘤體直徑達(dá)4-5mm時(shí)，選取5只小鼠給予吉非替尼治療2周，5只作為溶媒對(duì)照，每三天測(cè)量腫瘤大小，計(jì)算體積，判斷吉非替尼療效。
　　結(jié)果:1.成功建立移植瘤模型，P1、P2、P3和P4小鼠移植瘤成功率分別為50％、50％、100％和87.5％。
　　2.免疫

5、組織化學(xué)和免疫印跡法確證，各代移植瘤EGFRL858R蛋白表達(dá)均呈陽(yáng)性。
　　3.基因測(cè)序顯示，各代移植瘤EGFR基因21外顯子均存在L858R+V834L雙突變位點(diǎn)，確證其與原代腫瘤序列一致。
　　4.吉非替尼治療部分抑制L858R+V834L雙突變移植瘤體的生長(zhǎng)。
　　結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)首次成功構(gòu)建EGFR基因L858R+V834L雙突變位點(diǎn)的移植瘤小鼠模型，且基因型在傳代過程中保持一致;該模型對(duì)吉非替尼治療敏感，可作為

6、NSCLC患者EGFR基因突變陽(yáng)性靶向藥物篩選的模型。
　　第二章人非小細(xì)胞肺癌EML4-ALK融合基因原代動(dòng)物模型及crizotinib獲得性耐藥模型的構(gòu)建
　　目的:靶向治療是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的重要治療手段，近年來(lái)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多種新的治療靶點(diǎn)。ALK（Anaplasticlymphomakinase，間變性淋巴瘤激酶）融合基因，特別是EML4-ALK融合基因是當(dāng)前NSCLC靶向治療的新研究熱點(diǎn)。以Crizotini

7、b為代表的ALK抑制劑在臨床應(yīng)用取得了較好的療效，大多數(shù)ALK融合基因陽(yáng)性的NSCLC病人對(duì)Crizotinib敏感，但最后不可避免地在一年之內(nèi)因出現(xiàn)耐藥而復(fù)發(fā)，部分機(jī)制不明，還有患者可有多重耐藥出現(xiàn)，出現(xiàn)另一些激酶的活化如EGFR和其他酪氨酸激酶受體活性的增加，使得耐藥的具體機(jī)制更為復(fù)雜。已知Akt和ERK等信號(hào)通路，特別Akt和ERK磷酸化水平與ALK調(diào)控細(xì)胞生存與凋亡密切相關(guān)，也參與了crizotinib耐藥的發(fā)生。本研究將利用皮

8、下移植瘤技術(shù)建立原代非小細(xì)胞肺癌EML4-ALK融合基因小鼠，以此為模型，誘導(dǎo)crizotinib獲得性耐藥的發(fā)生，為尋找新型克服Crizotinib抵抗的ALK抑制劑，為臨床ALK融合基因肺癌Crizotinib獲得性耐藥患者的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:腫瘤標(biāo)本來(lái)源于湖南省長(zhǎng)沙市中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院手術(shù)患者，男性，40歲，左上肺腺癌，低分化?；蚍中痛_定其EML4-ALK融合基因陽(yáng)性。原代腫瘤組織被剪成1.0～1.5mm3大小

9、。雌性SCID小鼠背部皮下選取四個(gè)點(diǎn)接種瘤塊，每點(diǎn)兩塊，此為第一代荷瘤小鼠(P1)。當(dāng)某一點(diǎn)的皮下移植瘤直徑大于1cm時(shí)，處理小鼠，剝離腫瘤按上述方法接種第二批SCID小鼠(P2)，并重復(fù)上述步驟進(jìn)行腫瘤傳代，建立第三代荷瘤小鼠。三代小鼠腫瘤組織以ALK特異性抗體，采用免疫組織化學(xué)法和免疫印跡方法檢測(cè)ALK表達(dá)。RNA從腫瘤組織獲得經(jīng)RT-PCR后產(chǎn)物送測(cè)序。第三代小鼠接種后，當(dāng)瘤體直徑達(dá)8-9mm時(shí)，選取6只小鼠給予Crizotini

10、b治療2周，6只作為溶媒對(duì)照，每三天測(cè)量腫瘤大小，計(jì)算體積，判斷crizotinib療效。另有耐藥組10只持續(xù)給藥6個(gè)月誘導(dǎo)耐藥形成，提取腫瘤組織蛋白檢測(cè)相關(guān)蛋白磷酸化水平的變化。
　　結(jié)果:1.成功建立移植瘤模型，P1、P2和P3小鼠移植瘤成功率分別為50％、100％、和86.7％。
　　2.免疫組織化學(xué)和免疫印跡法確證，各代移植瘤EML4-ALK融合蛋白表達(dá)均呈陽(yáng)性。
　　3.基因測(cè)序顯示，各代移植瘤EML4-AL