雷帕霉素電紡絲緩釋藥膜抑制大鼠自體移植靜脈狹窄的實驗研究.pdf

1、研究背景:
　　 冠狀動脈旁路移植術(shù)(CoronaryArterialBypassGrafting，CABG)是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的重要臨床治療措施，2012年國際權(quán)威雜志NEJM的冠心病觀察性研究證實患者接受CABG治療可獲得比PCI治療更長的生存期[1]。臨床上作為CABG移植材料的主要有乳內(nèi)動脈、大隱靜脈和橈動脈，由于乳內(nèi)動脈和橈動脈取材的限制性，大隱靜脈一直作為CABG的重要取材血管。但移植后大隱靜脈橋狹窄發(fā)生率較

2、高，成為心血管外科亟需解決的臨床難題[2]。目前有關(guān)大隱靜脈橋狹窄防治的實驗研究集中在血管內(nèi)皮細胞及中層平滑肌細胞的干預(yù)治療上，而對于大隱靜脈主要管壁結(jié)構(gòu)——血管外膜的研究卻極少。近年來，血管外膜在移植血管狹窄中的作用開始受到重視，有研究提示血管外膜對于血管結(jié)構(gòu)和功能有著直接或間接的重要調(diào)控作用[3]。外膜成纖維細胞是血管外膜的主要細胞類型，越來越多的研究證實血管外膜成纖維細胞在移植血管病變過程中并非是無辜的旁觀者，而是積極的參與者[4

3、]。最近我們參與的課題組發(fā)現(xiàn)靜脈移植于動脈后因血管張力發(fā)生改變首先啟動移植靜脈外膜的成纖維細胞，分泌細胞外基質(zhì)(ECM)、各種生長因子、細胞因子，如TGF-β1、MCP-1、MMPs等，誘導(dǎo)外膜成纖維細胞增殖并轉(zhuǎn)化為成肌纖維細胞(myofibroblast，MF)[5]，向中膜層及內(nèi)膜遷移，參與新內(nèi)膜的形成。而目前國內(nèi)外尚無以外膜成纖維細胞為靶點，防治自體移植靜脈狹窄的研究。
　　 雷帕霉素(Rapamycin)，又稱西羅莫司，

4、是一種親脂性三烯含氮的大環(huán)內(nèi)酯抗生素類免疫抑制劑，具有很好的抗排斥作用，被廣泛應(yīng)用于器官移植[6，7]。由于它具有極好的抑制血管再狹窄的作用，近年來受到心血管研究領(lǐng)域的極大關(guān)注，被廣泛應(yīng)用于藥物支架涂層來預(yù)防血管成形術(shù)后再狹窄。同時，隨著對血管外膜研究的深入，雷帕霉素對血管外膜的作用也開始受到越來越多的關(guān)注[8]。臨床上大隱靜脈橋的狹窄一般發(fā)生于移植后幾周到幾個月的時間內(nèi)，對移植靜脈長期的干預(yù)治療才能有效地改善橋血管的狹窄[9]。因此我

5、們建立大鼠自體靜脈移植模型，在移植靜脈局部包裹攜帶雷帕霉素的新型電紡絲緩釋藥膜，觀察研究雷帕霉素緩釋系統(tǒng)能否通過血管外周釋放有效抑制自體移植靜脈新內(nèi)膜形成，從而改善移植靜脈的中遠期通暢率。
　　 藥物緩釋載體是防治移植靜脈的關(guān)鍵部分。目前用于制作藥物緩釋載體的材料多為人工合成的聚合物，如聚乙醇酸(PGA)及其共聚物PLGA，聚乳酸(PLA)等[10]。在實驗過程中發(fā)現(xiàn)此類聚合物存在不少缺點，如親水性差，細胞粘附力弱，產(chǎn)生酸性降解

6、產(chǎn)物從而引起無菌性炎癥等等。而可降解聚碳酸亞丙酯(PPC)是不釋放酸性產(chǎn)物的新型聚合物，其最終降解產(chǎn)物是二氧化碳和水[11]，最大程度地避免了藥膜接觸所引起的局部無菌炎癥。并且PPC的親水性和細胞粘附力明顯優(yōu)于PGA和PLA。電紡絲是一種制備高分子納米/微米纖維的新興方法，受到較多關(guān)注，由于電紡絲的直徑為微米/納米級[12]，大大增加了藥物釋放面積，其微觀結(jié)構(gòu)多孔，方便能量和物質(zhì)的跨膜交換。電紡絲可通過調(diào)整結(jié)晶性、共混比例、共聚組成及微

7、觀結(jié)構(gòu)等來調(diào)節(jié)降解速度，從而有效控制藥物緩釋[13]。我們通過建立雷帕霉素電紡絲緩釋藥膜，以探討其在防治自體移植靜脈狹窄的可行性和中遠期效果。
　　 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)作為雷帕霉素的主要作用靶點，是細胞生長和增殖的重要調(diào)節(jié)因子。mTOR信號及其表達產(chǎn)物的研究越來越受到人們的關(guān)注，大量研究顯示mTOR信號途徑的調(diào)控與細胞的生長與增殖密切相關(guān)[14]。mTOR在TOR1和TOR2被發(fā)現(xiàn)后即被鑒定并克隆，其氨基酸序列高

8、度保守，屬于磷酯酰肌醇激酶相關(guān)蛋白家族(PI3K)家族的成員，這一家族中的成員與細胞的基本功能有關(guān)，如:細胞增殖、DNA損傷修復(fù)、細胞周期以及端粒長度維護等[15]。FAK和MMPs(尤其是MMP2和MMP9)與血管外膜成纖維細胞增殖、遷移、粘附功能密切相關(guān)，PI3K/Akt/mTOR細胞傳導(dǎo)通路在成纖維細胞中的研究甚少[16]。研究雷帕霉素在此通路中的作用及能否調(diào)控FAK及MMPs的表達從而有效抑制成纖維細胞的增殖遷移，對移植靜脈外膜

9、炎癥及橋血管狹窄的研究有重要意義。
　　 目的:
　　 建立大鼠頸靜脈—腹主動脈自體血管移植模型，觀察自體移植靜脈狹窄病變，分析移植靜脈狹窄與外膜成纖維細胞、外膜炎癥的關(guān)聯(lián)。利用新興電紡絲技術(shù)制作雷帕霉素緩釋藥膜，將緩釋藥膜用于大鼠移植靜脈外周，觀察藥膜對移植靜脈狹窄及外膜炎癥的抑制作用。以自體移植靜脈的外膜成纖維細胞為研究靶點，從細胞水平分析外膜成纖維細胞增殖遷移對移植靜脈狹窄的影響，并從分子水平探討雷帕霉素通過外膜成

10、纖維細胞的PI3K/Akt/mTOR細胞傳導(dǎo)通路對FAK及MMPs表達的影響，從而防治移植靜脈的狹窄。為臨床冠狀動脈旁路移植術(shù)中，在大隱靜脈外周局部用藥抑制術(shù)后靜脈橋狹窄提供新的思路。
　　 方法:
　　 1、利用“Cuff”套管法制作Wistar大鼠頸靜脈—腹主動脈自體血管移植模型，分別于術(shù)后1周、4周、8周用血管超聲檢測橋血管是否通暢，并測定橋血管搏動指數(shù)(PI)及阻力指數(shù)(RI)，處死動物后移植靜脈行HE染色，計算

11、血管面積指數(shù)，血管外膜面積百分數(shù)及新生內(nèi)膜面積百分比，并行免疫組化染色，分析移植靜脈狹窄與外膜成纖維細胞、外膜炎癥的關(guān)聯(lián)。
　　 2、利用新興電紡絲技術(shù)，將PPC與雷帕霉素混勻后制成緩釋藥膜，共制三種藥膜（低濃度藥膜、高濃度藥膜、空白對照藥膜），用掃描電鏡觀察雷帕霉素緩釋藥膜的表面形態(tài)特征，將藥膜完全溶解后用紫外分光光度法測定雷帕霉素的載藥量和包封率。精確稱取雷帕霉素緩釋藥膜，放入PBS中，置于37℃恒溫水浴搖床中，在0.5d、

12、1d、2d、4d、6d、8d、10d、12d、14d、16d、18d、20d、22d、24d、26d、28d后，檢測殘余藥品中藥物含量，得到雷帕霉素藥物釋放曲線。
　　 3、重新建立大鼠自體血管移植模型，術(shù)中將雷帕霉素緩釋藥膜均勻緊密地纏繞于靜脈橋外周，分為對照組、空白藥膜組、低濃度藥物藥膜組、高濃度藥物藥膜組。于術(shù)后4周處死，處死后行HE染色，計算血管面積指數(shù)，新生內(nèi)膜面積百分比及血管外膜面積百分比，觀察雷帕霉素藥膜對移植靜脈

13、狹窄及外膜炎癥的抑制作用。并從細胞水平分析外膜成纖維細胞增殖遷移對移植靜脈狹窄的影響。
　　 4、取幼年大鼠腹主動脈外膜組織，剪碎后用培養(yǎng)瓶貼塊法培養(yǎng)原代血管外膜成纖維細胞。傳代成功后行細胞鑒定，MTT法檢測雷帕霉素藥膜對細胞活性的影響。細胞流式分析檢測各組藥膜對成纖維細胞周期的影響。用Transwell小室檢測空白藥膜及低、高濃度藥膜對細胞遷移能力的影響。WesternBlot檢測藥膜對外膜成纖維細胞FAK、pFAK、mTOR

14、、pmTOR、MMP2、MMP9、ERK1/2、PCNA等表達含量的影響。分析雷帕霉素通過外膜成纖維細胞的PI3K/Akt/mTOR細胞傳導(dǎo)通路對FAK及MMPs表達的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1、靜脈移植手術(shù)成功率90％，術(shù)后1周移植靜脈通暢率100％，術(shù)后4周通暢率88.9％，術(shù)后8周通暢率77.8％。血管超聲檢查顯示術(shù)后4周開始橋血管管壁明顯增厚，術(shù)后4周及術(shù)后8周橋血管搏動指數(shù)PI及阻力指數(shù)RI均明顯大于靜脈對

15、照組。大鼠處死后靜脈橋HE染色顯示，術(shù)后4周及術(shù)后8周靜脈橋內(nèi)膜增生明顯。其管壁面積指數(shù)AI及外膜面積百分比均明顯增高于靜脈對照組。說明術(shù)后4周及8周橋血管阻力增加，血管外膜增厚伴新內(nèi)膜形成，造成移植靜脈的狹窄。免疫組化顯示靜脈橋形成的新內(nèi)膜有大量vimentin和α-SMA表達陽性的細胞，說明在靜脈移植術(shù)后，靜脈外膜最先出現(xiàn)病理變化，外膜成纖維細胞增殖，轉(zhuǎn)型為成肌纖維細胞，遷移至靜脈內(nèi)膜參與內(nèi)膜增生，造成移植靜脈狹窄的病理過程。

16、>　　 2、雷帕霉素/PPC緩釋藥膜的制作條件較為嚴格，必須是紡絲距離為15-20cm，紡絲電壓為10-15kV才能順利流暢地進行電紡絲制作。通過掃描電鏡觀察，電紡絲纖維光滑均勻，交織成立體網(wǎng)格狀，纖維平均直徑為3μm。利用紫外分光光度法測得雷帕霉素在低濃度藥膜和高濃度藥膜中載藥量分別為4.5％、10.3％，包封率分別為95.1％、90.6％。利用HPLC法測得雷帕霉素緩釋藥膜的釋放曲線，5％雷帕霉素緩釋藥膜在前8天釋放較快，釋放41

17、％，到28天釋放91.5％。10％雷帕霉素緩釋藥膜在前6天釋放較快，釋放40％，到28天釋放93％。是一種成功的雷帕霉素緩釋系統(tǒng)。
　　 3、將雷帕霉素緩釋藥膜用于動物模型，術(shù)后4周緩釋藥膜明顯抑制了靜脈橋新內(nèi)膜的形成，內(nèi)膜上成纖維細胞明顯減少，移植靜脈狹窄明顯減輕，同時靜脈外膜厚度亦明顯變薄。免疫組化顯示藥膜明顯降低血管外膜FAK、PCNA、mTOR、MMP2及MMP9的陽性表達百分比。
　　 4、培養(yǎng)瓶組織貼塊法行細

18、胞培養(yǎng)時，于第7-9天開始組織塊周圍長出細胞，第10-12天細胞融合至80％左右，原代傳代，細胞生長旺盛，2-4天即可再次傳代。細胞免疫熒光檢測vimentin為陽性表達，而α-SMA和desmin為陰性表達，可以鑒定為血管外膜成纖維細胞。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)在藥膜上生長3天的VAF仍呈伸展狀態(tài)，有的細胞進入電紡絲網(wǎng)格內(nèi)，但在雷帕霉素藥膜上的細胞伸展性明顯差于空白PPC膜上的細胞。MTT檢測提示PPC材料對成纖維細胞活性無影響，雷帕霉素藥膜

19、可以明顯抑制成纖維細胞的活性。細胞流式分析顯示雷帕霉素藥膜明顯抑制VAF由G1期進入S合成期。Transwell遷移分析顯示低濃度及高濃度藥膜均對成纖維細胞的遷移產(chǎn)生明顯抑制作用。WesternBlot分析示低濃度藥膜和高濃度藥膜均能明顯抑制成纖維細胞mTOR、pmTOR、ERK1/2、pERK1/2的表達，說明雷帕霉素參與到成纖維細胞PI3K/Akt/mTOR細胞通路中，藥膜同時抑制成纖維細胞FAK、pFAK、MMP2、MMP9的表達

20、，減弱了細胞的粘附遷移功能。
　　 結(jié)論:
　　 1、利用“Cuff”套管法可成功制作大鼠頸靜脈-腹主動脈自體血管移植模型。自體靜脈移植術(shù)后最先出現(xiàn)移植靜脈外膜的增厚及外膜成纖維細胞的增殖和向內(nèi)膜遷移，成纖維細胞參與靜脈橋新內(nèi)膜的形成，從而造成移植靜脈狹窄。
　　 2、雷帕霉素緩釋藥膜可穩(wěn)定釋放藥物，能持續(xù)釋放28天甚或更長時間，對自體移植靜脈狹窄及外膜炎癥有明顯抑制作用。
　　 3、通過組織貼塊法成功培