NK細(xì)胞在SIV-SHIV感染猴腸道粘膜炎癥反應(yīng)和細(xì)菌移位中的作用機(jī)制探討.pdf

1、由于腸道固有層富含高表達(dá)CCR5的CD4+T細(xì)胞，腸道粘膜系統(tǒng)成為HIV/SIV的入侵部位、主要復(fù)制和藏匿場(chǎng)所。研究表明，病毒的入侵感染以及粘膜微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的破壞極易引發(fā)腸道粘膜炎癥反應(yīng)。同時(shí)，HIV/SIV感染對(duì)腸道粘膜屏障持續(xù)破壞，容易導(dǎo)致宿主發(fā)生細(xì)菌移位，造成內(nèi)毒素血癥。炎癥反應(yīng)和細(xì)菌移位的發(fā)生都會(huì)引起機(jī)體免疫系統(tǒng)的進(jìn)一步激活，艾滋病毒的持續(xù)感染致使機(jī)體免疫系統(tǒng)逐漸耗竭，加速疾病進(jìn)程的同時(shí)極大地增大了機(jī)會(huì)性感染的發(fā)生概率。自然殺傷細(xì)

2、胞(NK細(xì)胞)作為天然免疫系統(tǒng)的重要組分，其在抗HIV/SIV感染中的重要作用已經(jīng)被諸多文獻(xiàn)證實(shí)，但研究多集中在外周循環(huán)，其在粘膜部位的抗艾滋病感染免疫機(jī)制尚缺乏相關(guān)研究。此外，近期研究發(fā)現(xiàn)一群特殊的NK細(xì)胞—NKp44+NK細(xì)胞，其定位分布于粘膜部位，主要通過(guò)分泌IL-22發(fā)揮粘膜保護(hù)作用。因此，本研究主要針對(duì)粘膜NK細(xì)胞亞群在艾滋病感染腸道炎癥反應(yīng)和細(xì)菌移位中的作用機(jī)制進(jìn)行探討。
　　 本研究首先探索經(jīng)典N(xiāo)K細(xì)胞和NKp44

3、+NK細(xì)胞在SIV急性感染期的抗病毒和粘膜保護(hù)作用機(jī)制。選用正常中國(guó)恒河猴，分別在SIVmac239感染早期的不同時(shí)間點(diǎn)手術(shù)或安樂(lè)取腸道粘膜組織，進(jìn)行粘膜相關(guān)淋巴組織(mucosa-associatedlymphoidtissues，MALTs)淋巴細(xì)胞的分離和各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)工作，同時(shí)結(jié)合動(dòng)物病毒感染進(jìn)程和免疫系統(tǒng)的各種變化趨勢(shì)，分析腸道粘膜部位NK細(xì)胞在艾滋病毒早期感染中的主要作用機(jī)制。結(jié)果顯示，經(jīng)靜脈途徑接種的SIV病毒能迅速擴(kuò)散至

4、腸道粘膜部位，并進(jìn)行高水平復(fù)制，同時(shí)造成CD4+T細(xì)胞數(shù)量大幅度減少。此外，SIV感染急性期MALTsCD56-CD16+NK細(xì)胞亞群比例增幅明顯，同時(shí)細(xì)胞毒性功能增強(qiáng)；CD56-CD16-NK細(xì)胞亞群數(shù)量減少，功能無(wú)明顯變化；CD56+CD16+和CD56+CD16-NK細(xì)胞數(shù)量比例略有增加趨勢(shì)，但免疫調(diào)節(jié)功能顯著降低。這些變化趨勢(shì)揭示，粘膜部位NK細(xì)胞通過(guò)增強(qiáng)脫顆粒作用發(fā)揮積極的殺傷病毒感染靶細(xì)胞作用。此外，腸組織中炎癥因子IL-1

5、0水平在感染后一周內(nèi)出現(xiàn)明顯的增高波動(dòng)峰，說(shuō)明病毒感染引起了炎癥反應(yīng)的發(fā)生。在SIV感染一周內(nèi)，腸道粘膜NKp44+NK細(xì)胞數(shù)量比例呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，同時(shí)隨著感染時(shí)間的增加其產(chǎn)生IL-22水平逐漸增強(qiáng)。表明SIV感染早期雖有炎癥反應(yīng)發(fā)生，但NKp44+NK細(xì)胞通過(guò)數(shù)量擴(kuò)增和增加IL-22的分泌降低炎癥反應(yīng)，在維持粘膜正常屏障功能和穩(wěn)態(tài)平衡起到了積極作用。
　　 其次，為進(jìn)一步探索艾滋病慢性感染期NK細(xì)胞在腸道細(xì)菌移位發(fā)生中的作

6、用，本研究通過(guò)血漿細(xì)菌內(nèi)毒素水平和血常規(guī)指標(biāo)，將SHIV-1157ipd3N4慢性感染動(dòng)物分為L(zhǎng)PShigh和LPSlow兩組，對(duì)兩組動(dòng)物外周、粘膜系統(tǒng)的經(jīng)典N(xiāo)K細(xì)胞和NK-22細(xì)胞亞群數(shù)量和功能變化作了對(duì)比分析。結(jié)果表明，在SHIV慢性感染期，血漿內(nèi)毒素水平的高低與SHIV病毒在外周和粘膜部位的復(fù)制水平無(wú)直接關(guān)系，但直腸途徑感染可能會(huì)增加動(dòng)物細(xì)菌移位發(fā)生概率。內(nèi)毒素血癥促進(jìn)T細(xì)胞的進(jìn)一步激活，表現(xiàn)為病毒對(duì)CD4+T細(xì)胞的進(jìn)一步損毀和C

7、D8+T細(xì)胞的增殖。NKp44+NK細(xì)胞慢性感染期數(shù)量減少，且產(chǎn)生IL-22的水平明顯較低，該群細(xì)胞粘膜保護(hù)功能異?？赡苁窃斐杉?xì)菌移位的原因之一；發(fā)生細(xì)菌移位動(dòng)物粘膜NKp44+NK細(xì)胞脫顆粒殺傷能力有所增強(qiáng)，但這種功能潛能的轉(zhuǎn)變并不能對(duì)細(xì)菌移位產(chǎn)生積極作用。所以，NKp44+NK細(xì)胞正常粘膜保護(hù)作用的發(fā)揮對(duì)于降低細(xì)菌移位發(fā)生概率，維持粘膜完整性和穩(wěn)態(tài)平衡具有重要意義。SHIV慢性感染期經(jīng)典N(xiāo)K細(xì)胞功能出現(xiàn)缺陷，細(xì)菌移位可能使其活化程度

8、增高，但卻不能發(fā)揮正?？垢腥竟δ?。因此，艾滋病慢性感染期，粘膜免疫功能的缺陷和異?？赡苁窃斐杉?xì)菌移位發(fā)生的重要因素。此外，漿細(xì)胞分泌IgA等抗體能力也可能是影響細(xì)菌移位發(fā)生的重要免疫因素。
　　 最后，為準(zhǔn)確檢測(cè)艾滋病猴模型特異性細(xì)胞免疫，優(yōu)化、確定胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(ICS)影響因素和條件。本研究使用三種多克隆激活劑分別刺激SIV感染猴外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，確定最佳陽(yáng)性刺激物和刺激時(shí)間；然后使用五種濃度SIVmac239

9、混合肽庫(kù)分別刺激SIV感染猴PBMC，體外培養(yǎng)，不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞染色和流式檢測(cè)，確定肽庫(kù)的最適刺激濃度和最佳刺激時(shí)間。最后，初步應(yīng)用該方法檢測(cè)SIV感染猴細(xì)胞免疫水平。最終結(jié)果確定PMA+離子霉素組合可用作本實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性刺激物；2μg/mL肽庫(kù),37℃5％CO2培養(yǎng)16h，能更有效的刺激T細(xì)胞分泌TNF-α、IL-2、IFN-γ。該方法的優(yōu)化對(duì)艾滋病藥物的臨床前評(píng)價(jià)和疫苗研發(fā)等研究具有重要意義。
　　 因此，經(jīng)典N(xiāo)K細(xì)胞和NKp