重組蛋白Ag85A-IL-17A構(gòu)建及其抗哮喘小鼠氣道炎癥的實(shí)驗(yàn)研究生.pdf

1、研究背景:哮喘是一種以Th2型免疫反應(yīng)亢進(jìn)為特點(diǎn)的氣道慢性炎癥。IL-4、IL-13抗體在小鼠哮喘模型中發(fā)揮了一定程度的治療或者預(yù)防作用。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)IL-17A在哮喘的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用，尤其是以中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為特點(diǎn)的重癥哮喘。因此，我們推斷IL-17A抗體可能對(duì)重癥哮喘的治療或者預(yù)防起到一定作用。機(jī)體對(duì)于自身抗原機(jī)體通過一系列的免疫耐受過程避免自身免疫反應(yīng)，細(xì)胞因子自身不會(huì)在體內(nèi)誘導(dǎo)自身抗體的生成。Boissier推測(cè)如果自身

2、蛋白結(jié)合外源性蛋白，可以通過外源型蛋白的T細(xì)胞表位誘導(dǎo)B細(xì)胞反應(yīng)，產(chǎn)生自身蛋白相關(guān)的中和抗體。Ag85A是卡介苗(BCG)中免疫原性較強(qiáng)的蛋白復(fù)合體Ag85中的三個(gè)主要的蛋白之一，能夠刺激Th1型免疫反應(yīng)，提高IFN-γ和IL-12含量。
　　目的:構(gòu)建、表達(dá)重組蛋白Ag85A-IL-17A，研究其在哮喘小鼠氣道炎癥損傷中的作用。共分四步:(1)重組蛋白Ag85A-IL-17A的原核表達(dá)、純化;(2)重組蛋白Ag85A-IL-17

3、A的B細(xì)胞表位預(yù)測(cè);(3)重組蛋白Ag85A-IL-17A的免疫原性和抗原性檢測(cè);(4)重組蛋白Ag85A-IL-17A在哮喘小鼠氣道炎癥損傷中的作用。
　　方法:(1)利用分子克隆的方法，將IL-17a的基因片段克隆至pET28a-Ag85a，獲得pET28a-Ag85a-IL-17a的原核表達(dá)載體，將載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得重組蛋白Ag85A-IL-17A。SDS-PAGE電泳和Western

4、-blot鑒定正確的重組蛋白經(jīng)Ni-NTA親和層析及透析復(fù)性后即可獲得純化的Ag85A-IL-17A。(2)通過生物信息學(xué)的方法，使用Bcepred軟件預(yù)測(cè)重組蛋白Ag85A-IL-17A的B細(xì)胞表位，并與IL-17A的B細(xì)胞表位做對(duì)比。(3)利用免疫學(xué)的方法，分析重組蛋白Ag85A-IL-17A的抗原性和免疫原性。實(shí)驗(yàn)小鼠分三組，PBS組、Ag85A組、Ag85A-IL-17A組，分別檢測(cè)免疫蛋白后小鼠血清的IL-17A特異性抗體的滴

5、度。(4)構(gòu)建哮喘小鼠的動(dòng)物模型，免疫重組蛋白Ag85A-IL-17A，研究其對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥的作用。實(shí)驗(yàn)小鼠分四組，分別為PBS組、OVA組、OVB組以及Ag85A-IL-17A組。瑞吉氏染色觀察各組BALF中炎癥細(xì)胞數(shù)量及分類，ELISA測(cè)定BALF中Th2/Th17細(xì)胞因子含量，HE染色進(jìn)行肺組織病理切片炎癥評(píng)分，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)體外培養(yǎng)的脾細(xì)胞IL-13+T細(xì)胞含量以及RT-PCR檢測(cè)肺組織趨化因子CXCL1、CCL2及轉(zhuǎn)錄因子

6、RORγt的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:克隆獲得編碼序列經(jīng)測(cè)序鑒定與GenBank中的數(shù)據(jù)一致，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET28a-Ag85a-IL-17a，經(jīng)SDS-PAGE電泳和Western-blot鑒定蛋白Ag85A-IL-17A在E.coli中成功表達(dá)。重組蛋白DNA序列包含1287個(gè)堿基，蛋白含429個(gè)氨基酸，蛋白的分子量在50kDA左右。重組蛋白Ag85A-IL-17A保留了IL-17A的3個(gè)的B細(xì)胞表位，分別是LGAKVSS

7、RRPSDYLNRST176-193，TLHRNEDP197-204，和LVLKREP242-248。重組蛋白Ag85A-IL-17A具有抗原性，能夠與IL-17A抗體結(jié)合，并且具有免疫原性，能夠誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生較高濃度的IL-17A特異性抗體。OVB組哮喘小鼠模型BALF中IL-17A、IL-6明顯高于普通哮喘小鼠模型，其炎癥細(xì)胞分類中性粒細(xì)胞明顯高于OVA組哮喘小鼠模型。重組蛋白Ag85A-IL-17A顯著降低了BALF中Th17型

8、細(xì)胞因子IL-17A、IL-6的含量以及Th2型細(xì)胞因子IL-13、IL-4的水平。重組蛋白Ag85A-IL-17A明顯降低免疫小鼠小氣道周圍炎癥以及BALF中總細(xì)胞數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的數(shù)量。重組蛋白Ag85A-IL-17A免疫小鼠的體外培養(yǎng)的脾細(xì)胞IL-13+T細(xì)胞的數(shù)量較OVB哮喘組明顯降低，肺組織CXCL1和CCL2mRNA的水平也明顯降低，而轉(zhuǎn)錄因子ROR-γt的表達(dá)水平?jīng)]有明顯改變。
　　結(jié)論:(1)成功構(gòu)建、