保護血管內(nèi)皮細胞的食藥用真菌粗提物篩選及對高糖損傷內(nèi)皮的保護作用.pdf

1、本文從以下幾個方面進行論述。
　　第一部分高糖誘導HUVECs損傷模型的建立及食藥用真菌粗提物的篩選
　　目的：
　　觀察古尼蟲草、花臉香菇、冬蟲夏草、巴西革耳4種食藥用真菌粗提物對高糖誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）增殖活性的影響，篩選具有保護內(nèi)皮細胞活性的有效菌菇。
　　方法：
　　體外原代培養(yǎng)HUVECs，以細胞形態(tài)及免疫細胞化學染色法鑒定內(nèi)皮細胞。HUVECs分為對照組(M199正常培養(yǎng)液)、

2、高糖組（40mmol/L高糖培養(yǎng)液）、4種食藥用真菌（古尼蟲草、花臉香菇、冬蟲夏草和巴西革耳）粗提物干預組（每種粗提物以終濃度12.5、25、50、100ug/ml+高糖培養(yǎng)液），以四甲基偶氮唑藍（MTT）比色法檢測細胞增殖活性。
　　結(jié)果：
　　1. HUVECs于80％融合時呈單層鋪路石樣外觀，95%以上細胞Ⅷ因子檢測呈陽性。
　　2.高糖（40mmol/L）作用48h后HUVECs的MTT OD值顯著低于正常對照

3、組（P<0.05）。與高糖組相比，古尼蟲草粗提物（12.5-100 ug/ml）干預后HUVECs的OD值無明顯改變（P>0.05）；花臉香菇及巴西革耳隨著干預濃度增加（12.5-100ug/ml），各組OD值均顯著降低(P<0.05)，并呈劑量依賴性遞減趨勢；而冬蟲夏草粗提物（12.5-50ug/ml）干預后， HUVECs的OD值顯著增加（P<0.05），并呈劑量依賴性；但在100 ug/ml冬蟲夏草作用下，OD值反而稍下降，但較高

4、糖組仍有所上升，且有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　本實驗成功建立了高糖誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞體外損傷模型。冬蟲夏草粗提物在一定劑量范圍（12.5 umo l/L-50 umo l/L）內(nèi)呈劑量依賴性地抑制高糖誘導內(nèi)皮細胞損傷。而古尼蟲草、花臉香菇、巴西革耳等粗提取物對高糖誘導的內(nèi)皮細胞損傷無效。
　　第二部分冬蟲夏草粗提物保護高糖誘導內(nèi)皮細胞損傷的機制研究
　　目的：
　　糖尿病及其血管并發(fā)癥

5、嚴重威脅人類健康，已證實高血糖可通過多種直接或間接途徑損傷內(nèi)皮細胞，促進動脈粥樣硬化等血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。本研究旨在探討冬蟲夏草粗提物（CSE）對高糖誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）損傷的影響及機制。
　　方法：
　　體外原代培養(yǎng) HUVECs，用高糖(40mmol/L)誘導建立內(nèi)皮細胞損傷的體外模型。HUVECs分為對照組(M199正常培養(yǎng)液)、高糖組（40mmol/L高糖培養(yǎng)液）、冬蟲夏草粗提物干預組（以終濃度12

6、.5、25、50、100ug/ml）。以四甲基偶氮唑藍(MTT）比色法檢測細胞增殖活性；流式細胞術(shù)測定細胞周期分布和細胞內(nèi)活性氧（ROS）含量；分光光度法檢測細胞上清液中一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量；實時熒光定量 RT-PCR測定實時熒光定量RT-PCR檢測Nox4、eNOS、內(nèi)皮素-1、E選擇素及Sirt1的mRNA表達水平。
　　結(jié)果：
　　1.經(jīng)高糖干預48h后HUVECs的MTT法

7、吸光度值OD值顯著下降,G0/G1期的細胞百分率明顯增加，S+G2/M期的細胞百分率明顯下降,且 ROS水平亦增加（P均<0.05）。細胞上清液中NO、SOD含量減少，MDA含量增高（P均<0.05）。同時，細胞Nox4、內(nèi)皮素-1、E選擇素mRNA表達水平上調(diào)及eNOS、Sirt1 mRNA表達水平下調(diào)（P<0.05）。
　　2.與高糖組相比，CSE（12.5-50μg/mL）孵育48h后細胞OD值顯著提高（P<0.05）；G0

8、/G1期的細胞百分率明顯下降，S+G2/M期的細胞百分率明顯上升,且ROS水平降低（P均<0.05）；細胞上清液中NO、SOD含量升高，MDA含量降低（P均<0.05）。同時與高糖組相比，細胞Nox4、內(nèi)皮素-1、E選擇素的mRNA表達水平下調(diào)，eNOS、Sirt1的 mRNA表達水平上調(diào)（P<0.01）
　　結(jié)論：
　　冬蟲夏草粗提物可促進內(nèi)皮細胞生長增殖，促進細胞進入細胞周期進程抑制凋亡；可促進內(nèi)皮細胞NO分泌，下調(diào)E-