淫羊藿黃酮類成分在健康及骨質疏松病理狀態(tài)下大鼠腸道吸收代謝差異研究.pdf

1、制劑處方前研究藥物的吸收代謝等生物藥劑學性質對于預測藥物在體內的動態(tài)吸收過程起著關鍵的指導作用。淫羊藿黃酮具有很好的抗骨質疏松活性，本課題組前期研究表明:淫羊藿黃酮的吸收滲透系數(shù)較小，腸道吸收都較差，口服直接以原型的形式吸收很少，在腸道中主要被腸道菌和腸道酶水解為次級苷而易于吸收。但目前研究多以健康大鼠為研究對象，而在骨質疏松病理狀態(tài)下淫羊藿黃酮的生物藥劑學性質是否發(fā)生了變化，腸吸收特性、代謝途徑等生物藥劑學特性是否與健康狀態(tài)下的結果一

2、致卻未見文獻報道。文獻報道機體對藥物的處置過程在病理狀態(tài)下可能會改變，進而藥物的療效和不良反應也受到影響，而病理狀態(tài)下研究藥物的生物藥劑學特性能夠更好的模擬臨床，更真實的反應在疾病狀態(tài)下藥物的吸收情況，更能呈現(xiàn)生物利用度的問題。因此，本文旨在研究骨質疏松病理狀態(tài)下的淫羊藿黃酮腸道吸收代謝特性，比較其與健康狀態(tài)下的差異，為將其研究成高效的抗骨質疏松藥物制劑提供生物藥劑學研究基礎。
　　本文采用體外腸道菌和腸黏膜孵育以及在體大鼠腸灌流

3、多種方法，比較了淫羊藿黃酮在骨質疏松病理狀態(tài)和健康狀態(tài)大鼠腸道吸收代謝的差異。主要研究內容如下:
　　1.離體大鼠腸道菌、腸黏膜孵育樣品及大鼠腸灌流樣品分析方法學的建立建立了淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、寶藿苷I腸菌孵育和腸黏膜孵育樣品的高效液相分析方法，以及淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C大鼠腸灌流樣品的超高效液相分析方法。實驗結果表明所建方法準確、可靠。
　　2.淫羊藿黃酮在健康及骨質疏松病理狀態(tài)下大鼠腸

4、道菌和腸黏膜中的代謝差異研究
　　采用離體大鼠腸菌和腸黏膜孵育法，考察比較了在健康和骨質疏松病理狀態(tài)下淫羊藿黃酮的代謝差異性。結果均表明:骨質疏松病理組大鼠對淫羊藿黃酮類化合物的代謝作用明顯減弱，淫羊藿黃酮在骨質疏松病理狀態(tài)下的代謝速率比健康狀態(tài)下慢。
　　在用離體大鼠腸菌孵育淫羊藿黃酮時，淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C在健康組孵育1h后分別代謝了65％、63％、59％、51％，而在病理組孵育1h后分別只代謝了46％

5、、37％、40％、37％，且實驗以淫羊藿黃酮每個時間點的對數(shù)濃度和時間做線性回歸方程，斜率的絕對值越大代表代謝速率越快，結果進一步發(fā)現(xiàn)病理狀態(tài)下腸菌孵育時，淫羊藿黃酮類化合物的代謝速率明顯降低。不論是健康狀態(tài)還是骨質疏松病理狀態(tài)下，淫羊藿黃酮的代謝途徑沒有變化，均為在腸道菌群的作用下脫掉C-7位的糖基代謝為相應的次級苷，經UPLC/Q-TOF-MS鑒定相應的代謝產物，淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C的代謝產物分別為寶藿苷I、箭藿苷

6、A、箭藿苷B、2"-O-rhamnosylicarisideⅡ。寶藿苷I經腸菌孵育時，在健康和病理狀態(tài)下均未發(fā)生代謝。
　　離體大鼠腸黏膜孵育淫羊藿黃酮時，分別刮取大鼠的十二指腸、空腸、回腸和結腸段黏膜與藥物進行孵育。不論是在健康狀態(tài)還是病理狀態(tài)，淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C主要是被大鼠十二指腸和空腸段的腸道酶水解。孵育1h后，淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C在病理組十二指腸段分別剩余約32％、85％、78％、68

7、％未發(fā)生代謝，是健康組十二指腸段孵育相同時間后各化合物剩余含量的大約2.90倍、1.39倍、1.12倍、1.84倍;在空腸段孵育1h后，淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C分別剩余約28％、76％、91％、77％未發(fā)生代謝，是健康組空腸段孵育相同時間后各化合物剩余含量的大約1.87倍、1.13倍、1.10倍、2.56倍。孵育1h后，各化合物在病理組回腸段和結腸段幾乎未發(fā)生代謝。對于寶藿苷I，在健康組及骨質疏松病理組腸黏膜孵育時，在各腸

8、段均未發(fā)生代謝，沒有代謝產物的生成。經腸黏膜孵育后，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C的代謝產物與腸菌孵育時一致，淫羊藿苷略有不同，淫羊藿苷的主要代謝產物為脫掉C-7位的葡萄糖基后生成的寶藿苷I，另一個代謝產物推測可能是淫羊藿苷的重排產物，具體結構還需要做1HNMR，13CNMR等加以判斷。
　　3.實驗采用大鼠在體腸灌流法，研究比較了淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C在健康和骨質疏松狀態(tài)下在體腸吸收特性的差異
　　結果顯示:

9、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C在病理組大鼠各腸段的滲透系數(shù)和消除百分率與健康組相比，均明顯地減小。這幾個化合物在大鼠不同腸段的吸收存在差異，其中十二指腸和空腸腸壁滲透系數(shù)顯著高于回腸段和結腸段。淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C在病理組大鼠十二指腸、空腸、回腸、結腸的表觀滲透系數(shù)（P*eff值）比健康組各腸段的P*eff值分別減少了約29％～44％、32％～50％、40％～56％、27％～53％;在病理組大鼠十二指腸、空腸、

10、回腸、結腸的消除百分率也比健康組顯著地減少，減少的比例幾乎與P*eff值的減少比例大體一致。UPLC/Q-TOF-MS鑒定結果得知，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C腸灌流后的代謝產物與腸菌孵育一致，淫羊藿苷經大鼠腸灌流后的代謝產物與腸黏膜孵育的代謝產物一致。
　　4.采用Caco-2細胞模型研究了朝藿定A/B/C的吸收轉運機制
　　課題組前期系統(tǒng)研究了淫羊藿苷和寶藿苷I的吸收轉運特性，并未對朝藿定A/B/C做深入的研究，因此，本

11、課題在前期研究的基礎上，又對朝藿定A/B/C的吸收轉運機制做了深入的研究。實驗考察了維拉帕米、MK571和潘生丁三種不同的抑制劑對朝藿定A/B/C轉運的影響。結果顯示，加入BCRP的抑制劑（潘生?。r，朝藿定A/B/C從頂端側到基底側的轉運明顯增加而基底側到頂端側的轉運顯著被抑制。加入P-gp的抑制劑（維拉帕米）時，只有朝藿定A/C有上述結果。這三個化合物吸收滲透系數(shù)和分泌滲透系數(shù)的顯著性差異說明P-gp和BCRP可能參與了朝藿定A/C

12、的轉運而朝藿定B的轉運可能只有BCRP的參與。由此說明，腸吸收滲透性差和外排轉運蛋白(P-gp和BCRP)的參與可能是導致異戊烯基黃酮生物利用度差的主要原因。
　　綜上所述，不論是在離體還是在體的情況下，淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C在骨質疏松病理狀態(tài)下的吸收代謝與健康組相比均有顯著性的差異。在骨質疏松病理狀態(tài)下，淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C體外代謝速率，在體腸吸收滲透系數(shù)以及消除百分率均比健康組明顯降低。推測出