不同宮內(nèi)缺氧時程對胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響及當(dāng)歸保護(hù)作用.pdf

1、目的：探討宮內(nèi)缺氧狀態(tài)下，不同缺氧時程(3h，6h，9h，12h)對胚胎大鼠神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NESs)增殖的影響及當(dāng)歸注射液(Angelica injection)對不同缺氧時程狀態(tài)下神經(jīng)干細(xì)胞的保護(hù)作用是否有差異。 方法： ①動物配種及分組：將體重250-300克的成年雌性Wistar大鼠45只，分別與一只雄性Wistar大鼠配種，于第二日早晨發(fā)現(xiàn)陰栓記為妊娠0天，記下日期，取出雄鼠，單

2、獨飼養(yǎng)雌鼠至孕期15天。將孕鼠隨機分為：對照組(control group，CG)5只、缺氧組(hypoxia group，HG)20只和當(dāng)歸治療組(Angelica group，AG)20只。缺氧組再分為：缺氧3h組(HG-3h)、缺氧6h組(HG-6h)、缺氧9h組(HG-9h)、缺氧12h(HG-12h)各5只；當(dāng)歸治療組再分為：缺氧3h當(dāng)歸治療組(AG-3h)、缺氧6h當(dāng)歸治療組(AG-6h)、缺氧9h當(dāng)歸治療組(AG-9h)和

3、缺氧12h當(dāng)歸治療組(AG-12h)各5只。每只孕鼠可得胎鼠5-8只，每小組均隨機選10只胎鼠作為研究對象。 ②動物模型：將各缺氧組孕鼠經(jīng)尾靜脈緩慢注射生理鹽水8mL/kg體重，然后立即放入裝有200g鈉石灰(可吸收CO2)的4000mL容量的玻璃缸內(nèi)密閉。玻璃缸中間有一接口通過活塞連一氧氣袋，活塞與氧氣袋之間有一約50mL容量的小氣囊。玻璃缸側(cè)壁底端有一接口通過導(dǎo)管連接到GYS-Ⅱ型氧測定儀的探頭。孕鼠放在玻璃缸內(nèi)一定時間后將

4、導(dǎo)致孕鼠低張性缺氧(一般需20min)。當(dāng)GYS-Ⅱ型氧測定儀顯示窗顯示O2濃度為12％時，開始記錄缺氧時間。此時大多孕鼠表現(xiàn)為興奮、煩躁狀態(tài)，鼻唇和四肢輕度發(fā)紫、呼吸淺快時，從癥狀上也可判斷孕鼠達(dá)到缺氧狀態(tài)。當(dāng)顯示窗顯示0：濃度為10％時，通過活塞將小氣囊中氧氣緩慢擠壓入廣口瓶內(nèi)(可使氧分壓增加20mmHg)，使玻璃缸內(nèi)O2濃度始終維持在10％-12％之間，如此反復(fù)多次，直至孕鼠持續(xù)低張性缺氧達(dá)所需時間，再打開玻璃缸蓋復(fù)氧2小時(即放

5、在自然狀態(tài))。使用這種持續(xù)低張性缺氧模型分別導(dǎo)致胎鼠宮內(nèi)缺氧3h、6h、9h、12h。當(dāng)歸治療組孕鼠用250g/L的當(dāng)歸注射液代替生理鹽水，其余處理同缺氧組。對照組經(jīng)尾靜脈緩慢注射生理鹽水8mL/kg體重，但不缺氧。 ③取材、石蠟切片：將各孕鼠脫頸處死，快速剖腹取出胎鼠，將其整腦固定于10％中性福爾馬林。每組選10個胎鼠腦組織作常規(guī)水平位的石蠟切片(片厚4μm)。 ④免疫組化：各標(biāo)本均選一張切片，切片常規(guī)脫蠟下水后，微波

6、修復(fù)抗原，3％H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，5％BSA封閉交叉反應(yīng)。應(yīng)用常規(guī)免疫組織化學(xué)技術(shù)SABC法對切片進(jìn)行Nestin免疫組化染色。 ⑤圖像分析：對各免疫組化染色切片采用Ax07TRF-A顯微成像系統(tǒng)在400倍下觀察，每張切片在腦室系統(tǒng)周圍隨機選4個視野照相。用ImagePro-Plus 6.0(IPP6.0)圖像分析軟件分析，首先設(shè)定一個長8cm，寬4 cm的方框，以后每一張照片都選用此面積大小進(jìn)行分析。測得每張照片

7、中方框內(nèi)陽性結(jié)果的積分光密度(IOD)。取同一切片的4張照片的積分光密度的平均值為該例標(biāo)本的代表值。每個標(biāo)本均依此法圖像分析。 ⑥資料收集、整理，統(tǒng)計分析(組間比較用方差分析，兩兩比較用LSD檢驗)。匯總結(jié)果均以(X)±S表示，用SPSS15.0統(tǒng)計分析軟件包處理數(shù)據(jù)。對免疫組化測得的各組數(shù)據(jù)分別作正態(tài)分布檢驗和方差齊性檢驗，符合條件后采用單因素方差分析(one-way ANOVA)結(jié)果并用LSD法做多組數(shù)據(jù)間兩兩比較。

8、 結(jié)果： ①對照組Nestin免疫組化反應(yīng)陽性細(xì)胞的分布呈區(qū)域性，主要在室管膜上皮層(ependyma cortex)和室管膜下區(qū)(subventricular)。 ②缺氧組Nestin免疫組化反應(yīng)陽性細(xì)胞也主要分布在室管膜上皮層和室管膜下區(qū)，但同時也向周圍皮質(zhì)擴散。除缺氧12h組外，其余各缺氧組陽性細(xì)胞較對照組染色增強，數(shù)量增多。其陽性細(xì)胞的積分光密度(IOD)與對照組相比均有顯著性差異(P<0.05)(IODHG-3

9、h=18.92±4.04，IODHG-6h=23.73±9.14，IODHG-9h=19.76±3.57，IODCG=11.41±1.02)；而缺氧12h組陽性細(xì)胞較對照組染色明顯減弱，數(shù)量減少；其IOD值較對照組減小(P<0.05)(IODHG-12h=6.91±1.01)。并且在各缺氧組間，IOD的比較有統(tǒng)計差異(P＜0.05)。 ③當(dāng)歸治療組Nestin免疫組化反應(yīng)陽性細(xì)胞也分布在室管膜上皮層和室管膜下區(qū)。除當(dāng)歸治療12h

10、組外，其余各治療組陽性細(xì)胞較相應(yīng)缺氧組染色減弱，數(shù)量減少，其IOD值與相應(yīng)缺氧組比較均有顯著性差異(P＜0.05)(IODAG-3h=11.49±1.24，IODAG-6h=11.83±1.39，IODAG-9h=11.76±1.28)：而與對照組相比無明顯差別(P＞0.05)。當(dāng)歸治療12h組與缺氧12h組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)(IODAG-12h=9.71±2.34)。 結(jié)論： ①初步建立了較為科學(xué)的宮內(nèi)