PSMB5對神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力的影響.pdf

1、目的：
　　應(yīng)用基因沉默技術(shù)手段，觀察下調(diào)PSMB5對NSCs增殖潛能的影響，揭示年齡依賴性NSCs增殖能力降低的機(jī)制，以期為神經(jīng)退行性疾病的治療提供新思路。
　　方法：
　　1.體外分離培養(yǎng)胚胎(E14)、新生(P0)、幼年(P30)、成年(P90)和老年(P540)小鼠SVZ NSCs，觀察其神經(jīng)球形成周期和神經(jīng)球形成率。2.分別提取不同年齡階段（E14、P0、P30、P90、P540）Balb/c小鼠SVZ組織蛋

2、白，通過Western Blot分析其PSMB5蛋白的表達(dá)水平差異。3.設(shè)計(jì)合成PSMB5-siRNA，電穿孔法轉(zhuǎn)染NSCs，電轉(zhuǎn)后48h提取細(xì)胞總RNA，72h提取細(xì)胞全蛋白，RT-PCR及Western Blot分別從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平測定 PSMB5沉默效率，熒光分光光度法檢測蛋白酶體活性。4.測量神經(jīng)球平均直徑和數(shù)量，并應(yīng)用BrdU摻入實(shí)驗(yàn)分析PSMB5基因沉默對NSCs增殖能力的影響，5.Western Blot檢測細(xì)胞周期相

3、關(guān)蛋白Cyclin D1及CDK4的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1.分離培養(yǎng)的不同年齡階段小鼠NSCs，其中與E14或P0相比，P30、P90及P540小鼠NSCs形成神經(jīng)球的周期較長，神經(jīng)球形成率較低，提示NSCs增殖能力呈年齡依賴性下降趨勢；同時，Western Blot檢測各年齡組SVZ組織蛋白顯示PSMB5的表達(dá)水平隨年齡增高也呈遞減趨勢，提示PSMB5可能參與NSCs增殖能力的調(diào)控。2. Real-time PCR

4、定量分析法和Western Blot半定量分析法分別檢測siRNA組和對照組 PSMB5 mRNA及 PSMB5蛋白的表達(dá)變化，結(jié)果顯示 siRNA組 PSMB5 mRNA和蛋白表達(dá)水平較對照組分別降低61.23±1.62％和40.11±2.45%（P<0.05），且蛋白酶體活性較對照組降低24.36±0.14%（P<0.01），提示PSMB5-siRNA電轉(zhuǎn)染NSCs能夠抑制其PSMB5的表達(dá)，并下調(diào)蛋白酶體活性。3. siRNA組神

5、經(jīng)球平均直徑和數(shù)量均較對照組顯著降低（P<0.05）；BrdU摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示siRNA組BrdU陽性率21.58±3.29%較對照組53.47±7.36%顯著下降（P<0.05），提示PSMB5基因沉默能抑制NSCs增殖能力。4.應(yīng)用Western Blot半定量分析轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示siRNA組細(xì)胞周期依賴性蛋白Cyclin-D1及其激酶CDK4的表達(dá)水平分別較對照組下降46.82±3.14%和32.86±2