DR6重組表達(dá)載體的構(gòu)建及NAPP在畢赤酵母中的表達(dá)、純化及其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的初步研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種患病率高的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,以嚴(yán)重的高級(jí)認(rèn)知功能和記憶功能障礙為臨床特征。死亡受體-6(death receptor-6,DR6)是腫瘤壞死因子超家族中的成員,它是Ⅰ型跨膜受體,全長(zhǎng)655個(gè)氨基酸,理論分子量約為35KDa,在很多腫瘤細(xì)胞系中高表達(dá)。DR6在N末端有一段公認(rèn)的信號(hào)肽序列(1-41氨基酸),四個(gè)胞外半胱氨酸區(qū)域(42-211氨基酸),在它的胞漿段,包含有一個(gè)死亡

2、結(jié)構(gòu)域(428-494氨基酸)。淀粉樣前體蛋白(amyloid precursorprotein,APP)是一種Ⅰ型跨膜蛋白,由巨大的胞外氨基端區(qū),疏水的跨膜區(qū)及小段的胞內(nèi)羧基端區(qū)構(gòu)成。研究表明APP在細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞粘附、突起生長(zhǎng)、突觸發(fā)生、創(chuàng)傷修復(fù)等多方面有多種功能。然而,APP精確的生物學(xué)功能及其已知衍生物的功能至今仍然不是十分清楚。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn),APP是DR6的配體,在神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子被剝奪的條件下,觸發(fā)胞外APP的N端部分片段被β-

3、分泌酶切割脫落產(chǎn)生N-APP(amino-terminal fragment of APP),與表達(dá)于神經(jīng)元軸突上的DR6結(jié)合,以依賴(lài)于caspase-3和caspase-6的信號(hào)通路引起神經(jīng)元軸突的變性、崩解,并最終導(dǎo)致神經(jīng)元的凋亡,引發(fā)阿爾茨海默病。神經(jīng)元和軸突的退化是阿爾茨海默氏癥的生物標(biāo)志。因此,研究DR6、NAPP的功能、結(jié)構(gòu)及其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡作用與機(jī)制成為探索阿爾茨海默病病因、病理、定位AD治療藥物靶標(biāo)、開(kāi)發(fā)新的AD治療藥

4、物的有效途徑之一。
　　 本研究以含有DR6全長(zhǎng)cDNA的質(zhì)粒為模板,采用PCR方法擴(kuò)增DR6(aa42-218/aa42-349)的DNA片段,連接至畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K,成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-DR6(aa42-218/aa42-349),測(cè)序驗(yàn)證后將其電擊轉(zhuǎn)化至畢赤酵母菌株GS115,得到分別表達(dá)DR6不同氨基酸片段的兩個(gè)酵母重組子菌株。同時(shí)將實(shí)驗(yàn)室保存重組質(zhì)粒pPIC9K-NAPP(aa18-185)電擊轉(zhuǎn)

5、化畢赤酵母菌株GS115,經(jīng)過(guò)組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷平板篩選及抗G418篩選,得到高拷貝酵母重組轉(zhuǎn)化子。經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證,目的基因NAPP(aa18-185)轉(zhuǎn)入酵母菌中。鑒定酵母轉(zhuǎn)化子的甲醇利用型為Mut+后,經(jīng)甲醇誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)了高效分泌表達(dá),SDS-PAGE電泳顯示,表達(dá)上清中有分子量大小約為34 kD的外源蛋白產(chǎn)生,純化后Western blot證明其為目的蛋白。
　　 為了研究DR6和NAPP在神經(jīng)細(xì)胞中的作用,利用配體對(duì)受體作用,

6、還純化得到DR6的配體NAPP,用NAPP去刺激神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SHEP-1,看對(duì)其生長(zhǎng)凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)利用流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)不同濃度的NAPP處理培養(yǎng)的SHEP-1細(xì)胞的凋亡率。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示NAPP組凋亡指數(shù)分別為:處理12h各處理濃度(分別為0,2.5,5,10,20,40μg/ml)細(xì)胞凋亡率為(1.91±0.5)%(1.92±0.6)%(2.61±0.5)%(3.21±0.7)%(3.81

7、±0.8)%.;處理24h各處理濃度細(xì)胞凋亡率為(4.92±0.4)%(5.66±0.5)%(6.81.±0.6)%(7.57±0.4)%(7.29±0.8)%;處理48h各處理濃度細(xì)胞凋亡率為(5.46±0.4)%(6.38±0.1)%(8.08±0.4)%(9.51±0.5)%(8.91±0.6)%,與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Annexin V-FITC/PI法能特異地、準(zhǔn)確地檢出早期凋亡的細(xì)胞、繼發(fā)性壞死的細(xì)胞