PKCγ調(diào)控神經(jīng)病理性疼痛的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、研究背景：神經(jīng)病理性疼痛(Neuropathic Pain，NP)是臨床常見但卻缺乏有效治療手段的癥狀和疾病，其發(fā)生、發(fā)展和維持的生物學(xué)機(jī)制及其治療是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的研究課題。NP發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚，且缺乏有效的治療措施，因此對(duì)NP及其相關(guān)的疼痛分子靶機(jī)理進(jìn)行深入研究十分重要。眾多研究表明，PKCγ在NP中樞敏化過程中起著非常重要的作用，是慢性疼痛基因治療重要的分子靶，從而對(duì)PKCγ調(diào)控NP的確切機(jī)制值得深入研究。本研究擬從蛋白質(zhì)

2、組學(xué)結(jié)合RNA干擾技術(shù)探討NP重要分子靶的作用機(jī)理，不僅有利于NP病理機(jī)制研究方法的完善，而且能為NP研究提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和思路。
　　 目的：為闡明PKCγ調(diào)控神經(jīng)病理性疼痛的病理機(jī)制，本研究構(gòu)建介導(dǎo)PKCγ基因shRNA重組慢病毒載體，體外轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)元，觀察shRNA在體外對(duì)PKCγ表達(dá)的干擾效應(yīng)。鞘內(nèi)注射介導(dǎo)PKCγ基因shRNA的慢病毒載體于脊髓水平體內(nèi)沉默PKCγ基因表達(dá)，并觀察其對(duì)坐骨神經(jīng)結(jié)扎(CCI)致

3、神經(jīng)病理性疼痛大鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。應(yīng)用RNA干擾聯(lián)合蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)高通量檢測(cè)與PKCγ基因功能相關(guān)的蛋白質(zhì)，篩選鑒定出PKCγ調(diào)控NP的特異蛋白，發(fā)現(xiàn)NP治療新的靶點(diǎn)。
　　 方法：針對(duì)已篩選確定的PKCγ基因RNAi有效靶序列，合成靶序列的Oligo DNA，退火形成雙鏈DNA，與經(jīng)AgeⅠ和EcoRI酶切后的pGCSIL-GFP載體[含U6啟動(dòng)子和綠色熒光蛋白(GFP)]連接產(chǎn)生重組慢病毒載體pGCSIL-shPKCγ-GFP(

4、LV-shPKCγ)，PCR篩選陽性克隆，測(cè)序鑒定，從而構(gòu)建出介導(dǎo)PKCγ基因shRNA重組慢病毒載體。將LV-shPKCγ、pHelper1.0和pHelper2.0三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T包裝細(xì)胞，包裝后產(chǎn)生慢病毒，逐孔稀釋滴度法測(cè)定慢病毒滴度。將慢病毒體外轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)元細(xì)胞，神經(jīng)元細(xì)胞分為三組：Con組，未感染任何病毒的細(xì)胞組(Control)；NC組，加陰性對(duì)照病毒感染的細(xì)胞組(Negative Control)；RNAi

5、組，加RNA干擾靶點(diǎn)病毒感染的細(xì)胞組(Knock Down)，以Con組為對(duì)照，慢病毒轉(zhuǎn)染神經(jīng)元3天后，觀察綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)情況。以Con組及NC組為對(duì)照，慢病毒感染神經(jīng)元細(xì)胞5天后，Real-time PCR和Western blot檢測(cè)PKCγ基因mRNA和蛋白表達(dá)水平的干擾效率。
　　 成年雄性SD大鼠，體重260～320g，鞘內(nèi)置管成功5天后，建立坐骨神經(jīng)結(jié)扎(CCI)致神經(jīng)病理性疼痛模型，隨機(jī)分為以下4組：C

6、CI+生理鹽水(NS組，n=24)；CCI+pGCSIL-GFP空白載體組(LV-NC組，n=32)；CCI+pGCSIL-shPKCy-GFP載體組(LV-shPKCγ組，n=32)；假手術(shù)組+生理鹽水(Sham組，n=24)，Sham組僅暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)分支，不結(jié)扎。CCI術(shù)后第5天，大鼠鞘內(nèi)分別注射兩種不同劑量NS，LV-NC或LV-shPKCγ各5μl及10μl。鞘內(nèi)給藥7天后各組各取16只大鼠斷頭處死，取L4-L5脊髓腰膨大處

7、，Real-time PCR檢測(cè)PKCγ mRNA的表達(dá)，Western blot法檢檢測(cè)脊髓組織PKCγ蛋白的表達(dá)。LV-NC組和LV-shPKCy組各取8只大鼠觀察GFP脊髓轉(zhuǎn)染效果。所有大鼠均測(cè)基礎(chǔ)痛閾值，并在第3天、1、2、3、4、5、6周時(shí)測(cè)定大鼠右后爪機(jī)械痛閾值(PMWT)和熱痛閾值(PWTL)。
　　 建立大鼠鞘內(nèi)置管及坐骨神經(jīng)結(jié)扎(CCI)致神經(jīng)病理性疼痛動(dòng)物模型，鞘內(nèi)注射介導(dǎo)PKCγ基因RNA干擾的重組慢病毒載

8、體IN-shPKCγ，脊髓水平穩(wěn)定沉默CCI致神經(jīng)病理性疼痛大鼠的PKCγ基因表達(dá)，然后建立空白載體組(CCI+LV-NC，LV-NC組，n=8)和慢病毒載體介導(dǎo)RNA干擾組(CCI+-LV-shPKCγ，LV-shPKCγ組，n=8)兩組大鼠脊髓組織的蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳(2-DE)表達(dá)譜，用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)結(jié)合生物信息學(xué)對(duì)兩組大鼠脊髓腰段蛋白質(zhì)表達(dá)譜的部分差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行分析和鑒定，We

9、stern blot驗(yàn)證其部分差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。
　　 結(jié)果：PCR鑒定和測(cè)序證實(shí)，本研究成功構(gòu)建了PKCγ shRNA的重組慢病毒載體LV-shPKCγ。包裝慢病毒后，濃縮慢病毒懸液的滴度為1×109 TU/ml。慢病毒載體體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)大鼠神經(jīng)元致PKCγ基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平均一致降低，與對(duì)照組比較，干擾組mRNA水平干擾效率達(dá)95％(P<0.05)，干擾組蛋白表達(dá)水平干擾效率達(dá)80％以上(P<0.05)。鞘內(nèi)注射LV

10、-shPKCγ7天后，與對(duì)照組比較，脊髓PKCγmRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；LV-NC組和LV-shPKCγ組脊髓背角均可見大量GFP綠色熒光蛋白表達(dá)：與對(duì)照組比較，LV-shPKCγ組PMWT和PTWL較注射前明顯延長，于第1周開始差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，鎮(zhèn)痛效應(yīng)可持續(xù)6周。
　　 LV-NC組和LV-shPKCγ組大鼠腰段脊髓組織雙向電泳圖譜中各分離出清晰的約1050個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，兩組蛋白質(zhì)斑點(diǎn)

11、總體分布相似，2-DE圖譜中分離出明顯差異表達(dá)的36個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，與LV-NC組比較LV-shPKCγ組有19個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)顯著上調(diào)，17個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)顯著下調(diào)。選取其中20個(gè)豐度較高、分辨清楚的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF MS質(zhì)譜鑒定分析，共獲得20個(gè)肽質(zhì)量指紋圖譜。利用Mascot查詢軟件搜索，共鑒定出18個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)。生物信息學(xué)分析初步鑒定的蛋白質(zhì)分類為：能量代謝酶類相關(guān)蛋白，抗氧化蛋白，分子伴侶、熱休克蛋白，突觸相關(guān)蛋白，

12、細(xì)胞骨架蛋白等。涉及到細(xì)胞代謝、分子基因表達(dá)調(diào)控、突觸傳遞等眾多事件，Western blot驗(yàn)證了SNAP-25、TERA及AR三個(gè)部分差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，同蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果的表達(dá)變化水平相一致。
　　 結(jié)論：
　　 1.本研究成功構(gòu)建了介導(dǎo)PKCγ基因shRNA重組慢病毒載體(LV-shPKCγ)。
　　 2.本研究構(gòu)建的重組慢病毒載體(LV-shPKCγ)能有效下調(diào)體外培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)元細(xì)胞PKCγ基因mRNA和