鉛在大腦內(nèi)的分布及其對(duì)樹突棘可塑性影響的初步研究.pdf

1、鉛是一種廣泛分布的環(huán)境重金屬毒物，具有顯著的神經(jīng)毒性，可以引起兒童學(xué)習(xí)記憶能力減弱和認(rèn)知功能障礙等。近年研究發(fā)現(xiàn)，血鉛濃度作為鉛中毒的生物標(biāo)志物并不能完全評(píng)價(jià)鉛的神經(jīng)毒性效應(yīng)，然而，這是否與鉛在大腦中的特殊分布以及蓄積有關(guān)，目前相關(guān)的報(bào)道甚少，因此，研究鉛在大腦中的分布對(duì)于闡明鉛神經(jīng)毒性作用機(jī)制具有重要的意義。
　　突觸可塑性是學(xué)習(xí)記憶形成的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)，包括功能可塑性和結(jié)構(gòu)可塑性，以往鉛損傷學(xué)習(xí)記憶功能的研究多集中于突觸的功能

2、可塑性，然而功能可塑性的改變并不能完全解釋鉛的神經(jīng)毒性機(jī)制。突觸的結(jié)構(gòu)可塑性是功能可塑性的基礎(chǔ)，因此，研究鉛暴露后突觸結(jié)構(gòu)可塑性的改變及其分子調(diào)控機(jī)制，對(duì)于闡明鉛損傷學(xué)習(xí)記憶功能的機(jī)制是一個(gè)新的突破口。
　　樹突棘可塑性是突觸結(jié)構(gòu)可塑性的重要組成部分，包括樹突棘密度和形態(tài)的變化。樹突棘作為興奮性突觸的突觸后膜，其數(shù)量和形態(tài)的變化對(duì)興奮性突觸傳遞具有顯著的影響，與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)。Neuroligin1（NLGN1）是位于興奮性

3、突觸后膜上的突觸黏附分子，調(diào)控興奮性突觸的形成與形態(tài)。因此，研究鉛暴露是否通過影響 NLGN1的功能導(dǎo)致樹突棘可塑性損傷進(jìn)而引起學(xué)習(xí)記憶功能障礙有可能為進(jìn)一步闡明鉛損傷學(xué)習(xí)記憶功能的機(jī)制提供新的線索。綜上，本課題集中研究了鉛在大腦內(nèi)的分布及其對(duì)樹突棘可塑性影響，并初步探討了NLGN1在其中的作用。
　　目的：
　　本研究通過建立鉛暴露大鼠模型和原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元鉛暴露模型，綜合應(yīng)用形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)及功能學(xué)評(píng)價(jià)等技術(shù)手段

4、，觀察鉛在大腦內(nèi)的分布，研究鉛的蓄積對(duì)樹突棘可塑性的影響，并進(jìn)一步探討NLGN1在其中的作用。研究結(jié)果將有助于進(jìn)一步闡明鉛損傷學(xué)習(xí)記憶功能的分子機(jī)制，為探索潛在藥物治療靶點(diǎn)提供新的理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.建立模型
　　1)動(dòng)物模型：孕期鉛暴露大鼠模型，分為對(duì)照組、鉛暴露組，通過飲水染毒，劑量為0、0.005％、0.01%和0.02%的醋酸鉛，在P10（postnatal day）結(jié)束鉛暴露，將P30雄性大鼠作為

5、研究對(duì)象。
　　2)細(xì)胞模型：原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元鉛暴露模型，鉛暴露濃度為0、0.1、1μmol/L的醋酸鉛，在DIV7（days in vitro）進(jìn)行鉛暴露，持續(xù)5 d，于DIV12進(jìn)行觀察。
　　2.利用原子吸收分光光度法檢測(cè)鉛在血液和大腦中的含量。
　　3.采用AMG（Autometallography）和XFM（X-ray flurescence microspectroscopy）檢測(cè)鉛在大腦中的分布。<

6、br>　　4.采用全細(xì)胞膜片鉗記錄檢測(cè)鉛對(duì)大鼠海馬LTP的影響。
　　5.通過尼氏染色觀察鉛暴露對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量的影響；Golgi染色結(jié)合Imaris軟件觀察鉛暴露對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元樹突發(fā)育和樹突棘的影響。
　　6.采用MTT法測(cè)定鉛對(duì)原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元存活的影響，篩選合適的鉛暴露濃度。
　　7.利用免疫印跡法（Western Blot）觀察鉛暴露對(duì)大鼠海馬組織和原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元中NLGN1、P

7、SD-95和NR-2A蛋白表達(dá)的影響。
　　8.通過免疫熒光染色法觀察鉛暴露對(duì)原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元樹突棘的影響。
　　結(jié)果：
　　1.鉛在大鼠大腦內(nèi)的分布
　　1)檢測(cè)子代大鼠血鉛濃度發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，鉛暴露組大鼠在P0、3、7、10和21各時(shí)間點(diǎn)血鉛水平均顯著升高；而在P30，鉛暴露大鼠血鉛水平與對(duì)照組相比無顯著差異。
　　2) AMG結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，P10和P30鉛暴露組大鼠大腦中鉛的蓄積均

8、明顯增加，其中以海馬最為顯著。
　　3)原子吸收分光光度法結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，P10和P30鉛暴露大鼠海馬組織鉛含量顯著升高。
　　4) XFM實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，鉛暴露組大鼠大腦中鉛的含量顯著增多，且主要蓄積于海馬內(nèi)。
　　2.鉛暴露對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元樹突棘可塑性的影響
　　1)通過高頻刺激誘導(dǎo)大鼠海馬LTP發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，鉛暴露組EPSC的增加幅度顯著減小。
　　2)鉛暴露后海馬CA1區(qū)神

9、經(jīng)元密度、神經(jīng)元樹突分支數(shù)量無顯著變化，而神經(jīng)元樹突棘密度顯著降低，其中thin、filopodium和mushroom形態(tài)的樹突棘數(shù)量均顯著減少。
　　3)免疫熒光染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，鉛暴露組原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元樹突棘密度顯著降低。
　　3.鉛暴露對(duì)NLGN1、PSD-95和NR-2A蛋白表達(dá)的影響
　　1) Western Blot結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，鉛暴露組大鼠海馬組織中NLGN1、PSD-95和NR-

10、2A蛋白表達(dá)水平均顯著降低。
　　2) Western Blot結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，鉛暴露組原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的NLGN1、PSD-95和NR-2A蛋白表達(dá)量均顯著減少。
　　結(jié)論：
　　1.鉛暴露后大鼠大腦中鉛含量顯著增加，且呈不均勻分布，其中海馬為鉛主要蓄積的部位。
　　2.鉛暴露導(dǎo)致大鼠海馬LTP受損，表明神經(jīng)元突觸功能可塑性損傷。
　　3.鉛暴露導(dǎo)致大鼠海馬 CA1區(qū)神經(jīng)元樹突棘密度降低，且 th