幾種典型環(huán)境雌激素檢測的雙層類脂膜電化學免疫傳感技術(shù)研究.pdf

1、生物膜結(jié)構(gòu)和功能復雜,雙層類脂膜(BLMs)作為模擬生物膜模型已被廣泛接受。修飾了活性物質(zhì)的BLMs可作為離子轉(zhuǎn)運的通道,抗原-抗體鍵合的骨架,氧化還原反應(yīng)的雙極性電極或是能量轉(zhuǎn)化的器件,在研究各類生物分子與膜的相互作用,了解生物膜功能,開發(fā)新型生物傳感器方面發(fā)揮了重要作用。環(huán)境雌激素是一類存在于環(huán)境中,具有類似生物體內(nèi)雌激素活性的化學物質(zhì)。越來越多的證據(jù)顯示,許多被人類不合理釋放于環(huán)境中的化學污染物具有雌激素的生物效應(yīng)。建立準確、靈敏

2、、高效的環(huán)境雌激素檢測篩查方法對把握環(huán)境質(zhì)量、預防環(huán)境雌激素對人類造成的危害具有重要意義,現(xiàn)有環(huán)境雌激素的檢測篩查技術(shù)尚需進一步的補充完善。
　　本研究針對制約傳感器發(fā)展的固定化關(guān)鍵技術(shù),以17β-雌二醇,己烯雌酚,雙酚A等典型環(huán)境雌激素為代表,研究活性物質(zhì)(水溶性抗體和膜受體)在BLMs上的修飾,分別以雌激素抗體和膜受體(mER)作為功能元件,構(gòu)建基于BLMs的新型電化學免疫傳感器,并初步用于環(huán)境雌激素的檢測和篩查,主要研究內(nèi)容

3、包括:
　　1.固體支撐穩(wěn)定BLMs體系的構(gòu)建
　　(1)成膜液組成和配比的優(yōu)化:卵磷脂和膽固醇作為成膜液主要成分,研究了不同卵磷脂和膽固醇濃度和配比對BLMs穩(wěn)定性的影響。
　　(2)不同支撐材料的選擇及成膜技術(shù)研究:膜片電極作為支撐材料,分別嘗試了直接沾取成膜,成膜后再次自組裝及脂質(zhì)體成膜等幾種不同的BLMs制備方法,考察了不同方法形成脂膜的性能。
　　(3)BLMs的穩(wěn)定性考察:瓊脂作為支撐材料,進一步考察

4、了膜片電極和電化學鉑電極上瓊脂支撐BLMs的制備方法,構(gòu)建了瓊脂支撐穩(wěn)定的BLMs體系。
　　2.精氨酸多肽偶聯(lián)抗體制備技術(shù)研究
　　(1)適合偶聯(lián)修飾物的篩查及偶聯(lián)方法研究:實驗篩選了氨基壬烷,8個精氨酸組成的細胞穿膜肽(R8)等抗體偶聯(lián)修飾物。以17β-雌二醇抗體為代表,采用碳化二亞胺法實現(xiàn)了R8與抗體的偶聯(lián)。對反應(yīng)條件進行了優(yōu)化,實驗最后選擇EDC與R8反應(yīng)的摩爾比為10:1,活化時間為20min,在優(yōu)化好的條件下,M

5、ALDI-TOF-MS分析結(jié)果表明R8與抗17β-雌二醇抗體偶聯(lián)比約為5:1。
　　(2)修飾前后抗體的活性鑒定:SPR技術(shù)考察了抗體修飾前后親和常數(shù)。17β-雌二醇抗體修飾前后的親和常數(shù)分別為3.8509×10-5和2.3233×10-6,親和能力略有增加,提示R8修飾不影響17β-雌二醇抗體的結(jié)合位點及結(jié)合活性,可滿足下一步的測定要求。實驗同時觀察到相同摩爾濃度抗體修飾后與抗原結(jié)合引起SPR信號響應(yīng)增大,進一步證實了R8對抗體

6、的修飾。
　　(3)修飾位點的初步研究:對修飾位點進行了初步研究。利用MALDI-TOF-MS技術(shù),采用trypin酶解方法對修飾前后的雌二醇抗體進行了酶解,修飾R8后抗體在1496.8528Da,1624.9769Da,2013.2524Da處比較強的肽指紋峰消失,在低分子量(<600Da)范圍內(nèi)的肽指紋峰增加。實驗合成了適用于MALDI-TOF-MS的新基質(zhì)[CHC-][NH3+-Si-SBA-15-Si-NH3+][CHC-

7、],去除了基質(zhì)信號的干擾,考察了低分子量范圍內(nèi)肽指紋峰的變化。
　　3.R8偶聯(lián)抗體修飾BLMs電化學免疫傳感技術(shù)研究
　　(1)抗體修飾BLMs的研制:優(yōu)化了卵磷脂和膽固醇的濃度,卵磷脂濃度為20％,與膽固醇的質(zhì)量比在4:1-4.5:1之間時,形成的BLMs非常穩(wěn)定。采用兩步自組裝方法制備了17β-雌二醇修飾的BLMs,原子力掃描電鏡測試了空白成膜液和自組裝后成膜液的表面形態(tài),空白的成膜液AFM掃描結(jié)果非常光滑,在自組裝R

8、8修飾雌二醇抗體后,其AFM掃描結(jié)果可看到片片突起,修飾雌二醇抗體后相同電壓下BLMs的電流響應(yīng)值降低。實驗對抗體的自組裝時間進行了優(yōu)化,選擇30分鐘的自組裝時間。
　　(2)17β-雌二醇抗體修飾BLMs傳感器構(gòu)建:以修飾了雌二醇抗體的BLMs作為識別元件,采用競爭結(jié)合的方法,利用線性掃描法考察了17β-雌二醇對該生物傳感體系的響應(yīng)。對17β-雌二醇競爭結(jié)合物E2-BSA的濃度進行了優(yōu)化,在檢測體系中加入150μL1mg/mLE

9、2-BSA時與抗體的結(jié)合基本達到飽和。傳感器對17β-雌二醇的響應(yīng)范圍為0.01-0.20ng/mL,最低檢出濃度0.01ng/mL,并初步應(yīng)用于自來水樣的測定。在優(yōu)化好的條件下,考察了體系的抗干擾性能,雙酚A,己烯雌酚,4-壬基酚等常見環(huán)境雌激素對本體系均無響應(yīng)。
　　(3)己烯雌酚抗體修飾BLMs傳感器構(gòu)建:在優(yōu)化好的條件下,利用R8對己烯雌酚抗體進行修飾,制備了己烯雌酚抗體修飾的BLMs,競爭結(jié)合法測定了己烯雌酚對該生物傳感

10、體系的響應(yīng),建立的傳感器響應(yīng)體系對己烯雌酚的響應(yīng)范圍為0.10-0.20ng/mL,最低檢出濃度為0.10ng/mL,傳感器對雌二醇,雙酚A,4-壬基酚等常見環(huán)境雌激素顯示了良好的抗干擾性能,也進一步驗證了修飾方法和檢測體系的可行性。
　　4.mER修飾BLMs電化學免疫傳感技術(shù)研究
　　(1)mER修飾BLMs的構(gòu)建:利用生物膜上mER與卵磷脂和膽固醇組成成膜液良好的生物相容性實現(xiàn)mER與成膜液的融合,原子力掃描電鏡掃描觀

11、察到不同于空白成膜液的粗糙突起,進一步證實了mER在成膜液中的存在。
　　(2)方法條件優(yōu)化:對成膜條件進行了優(yōu)化,mER溶液與空白成膜液1:1混合時間為5min。修飾mER的BLMs穩(wěn)定性良好,在0-1.0V范圍內(nèi)的線性掃描結(jié)果表明:相同掃描電壓下與空白相比修飾了mER的BLMs膜電流略有增加,也進一步證實了修飾物在BLMs上的鑲嵌。
　　(3)mER修飾BLMs對典型雌激素的響應(yīng):采用線性掃描伏安方法考察了mER修飾BL

12、Ms對典型雌激素雌二醇的響應(yīng),該體系對17β-雌二醇方法的檢出限為1×10-10mol/L,17β-雌二醇濃度大于1×10-8mol/L時結(jié)合基本達到飽和。該體系對濃度為1×10-5mol/L雙酚A可產(chǎn)生響應(yīng),1×10-10mol/L17β-雌二醇和1×10-5mol/L雙酚A同時作用時存在協(xié)同效應(yīng),傳感器的響應(yīng)增強。
　　本研究建立了水溶性抗體及膜受體兩種不同的BLMs表面活性物質(zhì)固定化方法,通過對成膜條件和修飾方法的摸索,建立