醛糖還原酶調(diào)節(jié)小膠質(zhì)-巨噬細(xì)胞的極化及對(duì)脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響.pdf

1、脊髓損傷（Spinal Cord Injury，SCI）是一種導(dǎo)致重度癱瘓的疾病，且治療和康復(fù)的難度極大，給個(gè)人、家庭和社會(huì)都帶來(lái)沉重的精神壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。到目前為止臨床上還沒(méi)有找到有效治療SCI的方法或者藥物。脊髓損傷后形成的局部環(huán)境不利神經(jīng)元再生，是脊髓損傷難以治愈的主要原因之一。脊髓損傷后的炎癥反應(yīng)是脊髓損傷最為重要的病理過(guò)程，直接影響脊髓損傷后神經(jīng)再生的內(nèi)環(huán)境。小膠質(zhì)/巨噬細(xì)胞是脊髓損傷后最為重要的炎癥細(xì)胞，小膠質(zhì)/巨噬細(xì)胞極化

2、為M1或M2型細(xì)胞，是它們發(fā)揮不同生物功能的基礎(chǔ)。M1型小膠質(zhì)/巨噬細(xì)胞促進(jìn)炎癥發(fā)生，不利于神經(jīng)軸突的再生；而M2型小膠質(zhì)/巨噬細(xì)胞則抑制炎癥發(fā)生，促進(jìn)損傷組織的修復(fù)。醛糖還原酶（Aldose Reductase，AR）是糖代謝多元醇通路的關(guān)鍵限速酶之一，是體內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)化為山梨醇的唯一酶。在高血糖的情況下，約有33％（Petrash，2004）的葡糖糖進(jìn)入多元醇通路代謝，是產(chǎn)生糖尿病并發(fā)癥的重要因素。最近研究發(fā)現(xiàn)AR還參與巨噬細(xì)胞的炎癥

3、反應(yīng)，使用醛糖還原酶抑制劑（Aldose Reducase Inhibitor，ARI）后，可以抑制活化的巨噬細(xì)胞分泌促炎因子，減輕炎癥反應(yīng)。本碩士研究生課題是以AR為研究對(duì)象，通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，重點(diǎn)研究AR在脊髓損傷后的時(shí)間變化和組織細(xì)胞分布情況；AR對(duì)脊髓損傷修復(fù)的作用、對(duì)脊髓損傷后的炎癥反應(yīng)影響，探討AR對(duì)小膠質(zhì)/巨噬細(xì)胞極化方向的影響及其分子機(jī)制。本研究由以下兩部分實(shí)驗(yàn)組成：
　　實(shí)驗(yàn)的第一部分是脊髓損傷后AR的組織病理

4、學(xué)研究以及AR對(duì)脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響。該部分實(shí)驗(yàn)主要是應(yīng)用AR+/+小鼠，建立脊髓重度夾傷模型，分別選取假手術(shù)組，術(shù)后4h（小時(shí)）、8h、12h、1d（天）、3d、7d、14d等8個(gè)時(shí)間點(diǎn)。分別收集損傷中心上下各0.5cm的脊髓組織及組織提取物，分別進(jìn)行AR的免疫熒光組織化學(xué)染色、QPCR、Western Blot等檢測(cè)，觀察脊髓損傷后AR的表達(dá)變化模式。此外，利用AR+/+和AR-/-小鼠，觀察AR對(duì)脊髓夾傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的作

5、用。建立小鼠的脊髓重度夾傷模型，先期采用BBB運(yùn)動(dòng)學(xué)評(píng)分的方法（Basso，1996），來(lái)觀察AR+/+和AR-/-小鼠在損傷后的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況，并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。此外，選取術(shù)各組動(dòng)物脊髓重度夾傷后3d、7d、14d等幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)，應(yīng)用抗-GFAP免疫熒光組織化學(xué)染色方法，觀察比較兩組動(dòng)物的損傷區(qū)面積的大小，并做定量的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　實(shí)驗(yàn)第二部分則主要通過(guò)體內(nèi)和體外研究，探討AR對(duì)脊髓損傷后小膠質(zhì)/巨噬細(xì)胞的極化作用和機(jī)制。同實(shí)驗(yàn)

6、一的方法，建立AR+/+和AR-/-小鼠的脊髓重度夾傷模型，選取假手術(shù)組、以及脊髓夾傷術(shù)后4h、1d、3d、7d、14d、21d等幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)，應(yīng)用免疫熒光組織化學(xué)染色、QPCR、Western Blot等方法，觀察在mRNA和蛋白水平上，分別比較M1型和M2型細(xì)胞特異性標(biāo)志分子，如誘導(dǎo)性一氧化氮合成酶（iNOS）和精氨酸酶Ⅰ（ArginaseⅠ,ArgⅠ）的表達(dá)情況；同時(shí)觀察相關(guān)信號(hào)分子NF-κB和CREB的表達(dá)情況。此外，利用N9小膠

7、質(zhì)細(xì)胞系，體外培養(yǎng)，給予不同的極化刺激以及聯(lián)合ARI，觀察M1和M2特異性標(biāo)志分子的表達(dá)及相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)情況。
　　通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)在脊髓損傷后，AR在脊髓組織中表達(dá)上調(diào)，并在損傷后的第3天達(dá)到峰值。免疫組化研究顯示：脊髓損傷后，AR主要在神經(jīng)元和小膠質(zhì)/巨噬細(xì)胞的表達(dá)上調(diào)。這一現(xiàn)象在體外培養(yǎng)的原代神經(jīng)細(xì)胞中得到了驗(yàn)證。AR-/-小鼠脊髓損傷后，其運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)要好于AR+/+小鼠；且損傷后不同時(shí)間點(diǎn)上的損傷區(qū)面積也要小

8、于AR+/+小鼠。同AR+/+小鼠相比，AR-/-小鼠脊髓損傷后，損傷區(qū)聚集更多的ArgⅠ陽(yáng)性小膠質(zhì)/巨噬細(xì)胞，而iNOS陽(yáng)性細(xì)胞則較少。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，AR-/-小鼠在脊髓損傷后，M2型細(xì)胞特異性標(biāo)志分子ArgⅠ和CD206的表達(dá)水平要遠(yuǎn)高于AR+/+小鼠，而M1型細(xì)胞特異性標(biāo)志分子iNOS和CD86的表達(dá)水平則低于AR+/+小鼠。通過(guò)計(jì)算ArgⅠ/iNOS的比值分析，可以認(rèn)為在AR-/-小鼠在脊髓損傷后，小膠質(zhì)/巨噬細(xì)胞向M2方向極化。

9、
　　體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，AR-/-小鼠脊髓損傷后，脊髓組織中的NF-κB表達(dá)較AR+/+小鼠低；而檢測(cè)CREB的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AR-/-小鼠在脊髓損傷要多于AR+/+小鼠，同時(shí)，在活化的CREB的表達(dá)量上，AR-/-小鼠也要多于AR+/+小鼠。同樣通過(guò)體外培養(yǎng)N9小膠質(zhì)細(xì)胞系，給予不同的極化刺激并聯(lián)合ARI處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ARI可以抑制iNOS的表達(dá)，促進(jìn)ArgⅠ的表達(dá)，同時(shí)可以促進(jìn)CREB的表達(dá)。
　　通過(guò)上述研究發(fā)現(xiàn)：在AR缺失的