泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌臨床株W61耐藥與播散機(jī)制的基因組學(xué)研究.pdf

1、鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii，Ab)是醫(yī)院內(nèi)感染中常見的一種病原菌，其耐藥問題日趨嚴(yán)重，中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)報(bào)告，2010年鮑曼不動(dòng)桿菌泛耐藥株分離率高達(dá)21.4％，較2009年17.0％又有所增加，且均高于同年銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、腸桿菌科細(xì)菌的泛耐藥株分離率。多重耐藥和泛耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌，已成為臨床亟待解決的棘手難題。近年來，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，基因組學(xué)和比較基因組學(xué)的研究

2、方法為細(xì)菌學(xué)領(lǐng)域引入新的研究平臺(tái)。本實(shí)驗(yàn)采用微生物學(xué)、分子生物學(xué)和生物信息學(xué)分析方法揭示泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌臨床株W61的多重耐藥和耐藥播散的機(jī)制，為指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物，避免或減少細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)，防控細(xì)菌耐藥播散，研發(fā)新型抗菌藥物和新作用靶位提供依據(jù)。
　　研究目的：
　　1、了解泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌臨床株W61的基因組基本特征，分析其多重耐藥表型與耐藥基因型。
　　2、了解泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌臨床株W61基因組中外

3、排泵系統(tǒng)的分布，分析外排泵(AdeABC、AdeIJK、AdeFGH、AbeM、AbeS、CraA、MdtL AmvA及ABTJ_00034/35/36、ABTJ_00275/276/277等5個(gè)功能未知的外排泵)和外膜蛋白(OmpA、OmpW)的表達(dá)，探索外排泵和外膜蛋白在菌株多重耐藥中的作用。
　　3、了解泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌臨床株W61基因組中可移動(dòng)元件(整合子、轉(zhuǎn)座子、插入序列、質(zhì)粒)的分布，探討耐藥播散機(jī)制。
　　研

4、究方法：
　　1、菌株收集與藥敏試驗(yàn)：收集自2009年天津市某三級(jí)甲等醫(yī)院臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌W61，經(jīng)常規(guī)、生化、AP120NE紙條鑒定。采用微量肉湯稀釋法和瓊脂紙片擴(kuò)散法測(cè)定鮑曼不動(dòng)桿菌W61對(duì)16種常用抗菌藥物(哌拉西林他唑巴坦、頭孢氨噻肟、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢哌酮、頭孢吡肟、頭孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星、慶大霉素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、莫西沙星、亞胺培南、美羅培南、多粘菌素)的MIC值(或抑菌圈直徑)，確定其

5、耐藥表型。
　　2、全基因組高通量測(cè)序與序列分析：應(yīng)用Roche454 FLX測(cè)序平臺(tái)，對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌臨床株W61進(jìn)行全基因組測(cè)序，利用相關(guān)軟件和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)填補(bǔ)空缺片段，拼接完整的基因組序列，提交Genbank。應(yīng)用BASys細(xì)菌注釋系統(tǒng)進(jìn)行基因組和質(zhì)粒的基因注釋，分析菌株耐藥表型與耐藥基因型的關(guān)系。
　　3、泵抑制劑干預(yù)試驗(yàn)與外排泵及外膜蛋白基因表達(dá)檢測(cè)：采用微量肉湯稀釋法測(cè)定未加用和加用泵抑制劑CCCP時(shí)鮑

6、曼不動(dòng)桿菌臨床株W61對(duì)8種抗菌藥物(左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、氯霉素、慶大霉素、阿米卡星、頭孢他定、頭孢哌酮/舒巴坦)的MIC值，了解泵抑制劑對(duì)菌株耐藥表型的影響。應(yīng)用TransDB數(shù)據(jù)庫(kù)分析多重耐藥株W61基因組中外排泵系統(tǒng)的分布情況。選取鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC17978為對(duì)照株，以recA為內(nèi)參基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌W61和ATCC17978的13種外排泵基因(adeB、adeJ、adeG、abe

7、M、abeS、craA、mdtL、amvA及ABTJ_00035、ABTJ_00276等5個(gè)功能未知的泵基因)和2種外膜蛋白基因(ompA、ompW)mRNA的表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量分析。泛耐藥株W61外排泵AdeABC的調(diào)控系統(tǒng)AdeRS、外排泵ABTJ_00034/35/36上游調(diào)控序列ABTJ_00033和外排泵AdeFGH的調(diào)控系統(tǒng)AdeL的結(jié)構(gòu)基因，與GenBank公布的ATCC17978相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)分析。
　　4、可移動(dòng)

8、元件分布：應(yīng)用Genbank-nr和IS finder數(shù)據(jù)庫(kù)，經(jīng)序列比對(duì)分析鮑曼不動(dòng)桿菌臨床株W61基因組中可移動(dòng)元件(整合子、轉(zhuǎn)座子、插入序列、質(zhì)粒)的分布及其攜帶的耐藥基因，分析可移動(dòng)元件在菌株耐藥性的水平播散中的作用。
　　研究結(jié)果：
　　1、藥敏試驗(yàn)結(jié)果：鮑曼不動(dòng)桿菌臨床株W61對(duì)抗假單胞菌頭孢菌素、碳青霉烯類抗菌藥物、含舒巴坦的復(fù)合制劑、氟喹諾酮類抗菌藥物和氨基糖苷類抗菌藥物均耐藥，對(duì)多粘菌素敏感，為泛耐藥株。

9、r>　　2、基因組序列分析：泛耐藥株W61基因組(Genbank登錄號(hào)CP003500)全長(zhǎng)3964912bp，平均GC含量為39.11％，包含3731個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，6個(gè)rRNA編碼基因，74個(gè)tRNA編碼基因；泛耐藥株W61攜帶2個(gè)質(zhì)粒，plasmidA全長(zhǎng)77528bp，平均GC含量34.05％，含有109個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，plasmidB全長(zhǎng)110967 bp，平均GC含量41.61％，含有123個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因。基因組攜帶：

10、β-內(nèi)酰胺類耐藥基因ADC型ampC，氨基糖苷類耐藥基因(盒)aacA4、aadA1、aacC1、armA、strA、strB，氟喹諾酮類作用位點(diǎn)gyrA突變，碳?xì)涿瓜╊惸退幓騩xa-23、oxa-66，磺胺類耐藥基因sul1、su12，氯霉素耐藥基因盒catB8。
　　3、泵抑制劑對(duì)耐藥表型的影響及外排泵與外膜蛋白基因表達(dá)情況：泛耐藥株W61在使用CCCP后對(duì)8種抗菌藥物(左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、氯霉素、慶大霉素、阿米

11、卡星、頭孢他定、頭孢哌酮/舒巴坦)的MIC值均較前下降4倍或4倍以上。泛耐藥株W61基因組共包含RND家族外排泵8個(gè)，MFS家族外排泵6個(gè)，ABC家族外排泵1個(gè)，MATE家族外排泵2個(gè)，SMR家族外排泵3個(gè)。泛耐藥株W61外排泵基因adeB、abeM、ABTJ_00035、ABTJ_00276和外膜蛋白基因ompA的mRNA相對(duì)表達(dá)水平高于對(duì)照株ATCC17978，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。調(diào)控基因adeRS、ABTJ_00033出現(xiàn)基因突變

12、及缺失，而調(diào)控基因adeL序列無基因突變。外膜蛋白基因carO出現(xiàn)基因突變。
　　4、可移動(dòng)元件分布情況：泛耐藥株W61基因組攜帶可移動(dòng)原件：質(zhì)粒2個(gè)、Ⅰ類整合子2個(gè)、插入序列片段9類(包括ISCRs2個(gè))、轉(zhuǎn)座酶基因23個(gè)、AbaR型耐藥島1個(gè)。其中質(zhì)粒、Ⅰ類整合子和ISCRs均攜帶耐藥基因，并構(gòu)成耐藥基因簇-復(fù)合Ⅰ類整合子和AbaR型耐藥島。
　　研究結(jié)論：
　　1、泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌W61基因組(Genbank登

13、錄號(hào)CP003500)全長(zhǎng)3.96Mbp，包含2個(gè)質(zhì)粒。基因組和質(zhì)粒中攜帶β-內(nèi)酰胺類耐藥基因ampC、氨基糖苷類耐藥基因(盒)aacA4、aadA1、aacC1、armA、strA、strB、碳?xì)涿瓜╊惸退幓騩xa-23、oxa-66、磺胺類耐藥基因sul1、sul2、氯霉素耐藥基因盒catB8，存在氟喹諾酮類作用位點(diǎn)gyrA突變，與菌株泛耐藥表型相一致。
　　2、泵抑制劑CCCP的應(yīng)用，可使泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌W61對(duì)多種抗菌

14、藥物MIC值較前降低，這表明外排泵功能對(duì)菌株W61多重耐藥有一定貢獻(xiàn)。外排泵系統(tǒng)在泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌W61的基因組中廣泛分布，外排泵AdeABC、AbeM、ABTJ_00034/35/36、ABTJ_00275/276/277的高表達(dá)可能與菌株W61的多重耐藥有關(guān)，調(diào)控基因adeRS和ABTJ_00033基因突變和氨基酸替換可能與外排泵AdeABC和ABTJ_00034/35/36表達(dá)上調(diào)有關(guān)。
　　3、可移動(dòng)元件在泛耐藥鮑曼不動(dòng)