玉米絲氨酸消旋酶作為新型篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)化煙草的研究.pdf

1、絲氨酸消旋酶是一種雙功能酶，擁有消旋酶和脫水酶的作用，不僅能催化L-型和D-絲氨酸的相互轉(zhuǎn)化，還能將L-/D-絲氨酸轉(zhuǎn)化成丙酮酸。本研究利用玉米絲氨酸消旋酶基因，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)煙草葉片及愈傷組織進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，同時(shí)用GUS基因?qū)霟煵葜凶鳛閷?duì)照，對(duì)比玉米絲氨酸消旋酶和GUS基因在葉片及愈傷組織的轉(zhuǎn)化效果，為ZmSR作為新型無(wú)抗性篩選標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。本研究獲得了以下結(jié)果：
　　1、根據(jù)玉米絲氨酸消旋酶預(yù)測(cè)基因（NM_00114302

2、8.1）的登錄號(hào)在NCBI上進(jìn)行搜索，得知玉米絲氨酸消旋酶基因的片段大小為1303 bp。對(duì)重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-ZmSR，用Nco I和BstPⅠ進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，酶切產(chǎn)物電泳檢測(cè)得到ZmSR和pCAMBIA1301載體兩個(gè)大小的片段，初步證明ZmSR基因連接到pBI1301載體上。對(duì)載體pBI1301-ZmSR進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果與NCBI網(wǎng)站上所給出的ZmSR基因的序列完全一致。
　　2、制備根癌農(nóng)桿菌LBA440

3、4感受態(tài)細(xì)胞，并用液氮凍融法將pBI1301-ZmSR質(zhì)粒導(dǎo)入到LBA4404感受態(tài)細(xì)胞中。從農(nóng)桿菌中提取質(zhì)粒，進(jìn)一步酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒pBI1301-ZmSR，結(jié)果仍得到ZmSR和pCAMBIA1301載體兩個(gè)大小的片段。根據(jù)玉米絲氨酸消旋酶預(yù)測(cè)基因序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)新提取的農(nóng)桿菌pBI1301-ZmSR質(zhì)粒與pBI1301-ZmSR原始質(zhì)粒進(jìn)行PCR驗(yàn)證，擴(kuò)增出了玉米絲氨酸消旋酶基因的陽(yáng)性克隆，證明了重組質(zhì)粒已成功導(dǎo)入農(nóng)桿菌中，可以用來(lái)

4、進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。
　　3、通過(guò)對(duì)煙草培養(yǎng)基條件的篩選，優(yōu)化了煙草葉片最佳誘導(dǎo)愈傷的培養(yǎng)基為：MS+6-BA0.5 mg/L+NAA2.0 mg/L+蔗糖25 g/L+瓊脂6 g/L。該培養(yǎng)基的誘導(dǎo)愈傷的誘導(dǎo)率為100％，并且速度最快，愈傷增殖的效果最好。
　　4、本研究以質(zhì)粒pBI1301-ZmSR為目的基因，以質(zhì)粒pBI121-GUS作為對(duì)照，分別用D-絲氨酸和Kan作為篩選試劑，對(duì)未轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行Kan和D-絲氨酸抗性臨界濃

5、度的篩選。對(duì)煙草葉片進(jìn)行卡那霉素及D-絲氨酸的抗性敏感性試驗(yàn)，分別確定臨界濃度為50 mg/L和12 mM。對(duì)煙草愈傷組織進(jìn)行卡那霉素及D-絲氨酸的抗性敏感性試驗(yàn)，分別確定煙草愈傷組織的臨界濃度為30 mg/L和6 mM。
　　5、用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將pBI1301-ZmSR和pBI121-GUS分別轉(zhuǎn)入到煙草葉片和愈傷組織中，經(jīng)分子檢測(cè)由葉片篩選獲得的pBI1301-ZmSR抗性苗有3株為陽(yáng)性植株，由愈傷組織獲得的抗性苗有6株為陽(yáng)性