玉米絲氨酸消旋酶作為新型篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)化南抗楊的研究.pdf

1、楊樹作為林業(yè)生產(chǎn)中的模式植物，具有生長(zhǎng)速度快、適應(yīng)性強(qiáng)及產(chǎn)量大等優(yōu)點(diǎn)，在保護(hù)環(huán)境和維持生態(tài)平衡以及作為工業(yè)原料方面發(fā)揮重要作用。南抗楊是速生和豐產(chǎn)性能優(yōu)良的新品種。傳統(tǒng)的選擇標(biāo)記基因可能會(huì)發(fā)生基因漂流，會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境以及人類健康產(chǎn)生不良的影響。因此選擇一個(gè)有效并且安全的篩選標(biāo)記基因極為必要的。絲氨酸消旋酶（SR）作為一種雙功能酶，同時(shí)具有消旋酶和脫水酶活性，不僅能將L-/D-絲氨酸轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的D-/L-絲氨酸；而且可以將L-/D-絲氨酸轉(zhuǎn)

2、化成丙酮酸。絲氨酸消旋酶作為一種無(wú)抗性選擇標(biāo)記基因，對(duì)于植物中的D-絲氨酸具有解毒的功能，并且對(duì)于生態(tài)環(huán)境不會(huì)造成污染，是一種安全的篩選標(biāo)記基因。因此研究該標(biāo)記基因能否能在木本植物中高效表達(dá)，具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用前景。
　　本研究以南抗楊的葉片為受體材料，將含有ZmSR基因的質(zhì)粒導(dǎo)入到根癌農(nóng)桿菌LBA4404中，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將ZmSR基因?qū)氲侥峡箺钪?，并?duì)南抗楊的葉片和分化芽進(jìn)行D-絲氨酸的抗性篩選，最終對(duì)已轉(zhuǎn)化的抗性植

3、株進(jìn)行分子檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)獲得了以下結(jié)果：
　　(1)對(duì)重組載體進(jìn)行Bstp I、Nco I雙酶切驗(yàn)證，證明ZmSR基因正確連入表達(dá)載體；將質(zhì)粒pBI1301-ZmSR進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與玉米的絲氨酸消旋酶預(yù)測(cè)基因（NM_001143028.1）序列比對(duì)結(jié)果完全一致，證明質(zhì)粒pBI1301-ZmSR的正確性；制備根癌農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞，并通過液氮凍融法將質(zhì)粒pBI1301-ZmSR導(dǎo)入到LBA4404感受態(tài)細(xì)胞中。從農(nóng)桿菌中

4、提取質(zhì)粒進(jìn)行Bstp I、Nco I雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果得到ZmSR和pBI1301載體兩個(gè)大小的片段。根據(jù)玉米絲氨酸消旋酶基因序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)提取的農(nóng)桿菌pBI1301-ZmSR質(zhì)粒PCR驗(yàn)證，證明了重組質(zhì)粒已成功導(dǎo)入農(nóng)桿菌中，可以用來(lái)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。
　　(2)進(jìn)行了南抗楊葉片分化和不定芽生根的D-絲氨酸的敏感性試驗(yàn)，確定葉片分化的臨界濃度為15mM，生根的臨界濃度為12.5mM。
　　(3)以南抗楊組培苗的葉片為材料，通過農(nóng)

5、桿菌介導(dǎo)法將pBI1301-ZmSR導(dǎo)入到葉片以及愈傷組織進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，并以pBI121-GUS轉(zhuǎn)化南抗楊的葉片以及愈傷組織作為對(duì)照，對(duì)比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)GUS基因的南抗楊葉片以及愈傷組織比轉(zhuǎn)ZmSR基因分化率高，但轉(zhuǎn)ZmSR基因的污染率較轉(zhuǎn)GUS基因的污染率低。
　　(4)篩選轉(zhuǎn)化植株，最后共獲得12株D-絲氨酸抗性苗，經(jīng)分子檢測(cè)共有3株植株為陽(yáng)性植株。
　　(5)煉苗移栽并對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的表型性狀進(jìn)行觀察，非轉(zhuǎn)基因植株作為對(duì)照，