基于微流控芯片平臺腫瘤相關成纖維細胞在GRP78相關性人肺腺癌細胞對紫杉醇耐藥中的作用研究.pdf

1、目的:肺癌不論發(fā)病率或死亡率均在眾腫瘤中位居前列，成為對人群生命威脅最大的惡性腫瘤之一。而多數患者確診時為晚期肺癌，失去最佳手術時機，故化療在肺癌的治療中起主要作用。然而因腫瘤細胞易對化療藥物產生耐受性常常導致化療以失敗告終，所以如何改善肺癌細胞耐藥迫在眉睫。本實驗通過微流控芯片平臺，以人肺腺癌細胞A549細胞系為研究對象，以腫瘤微環(huán)境的主要基質細胞—腫瘤相關成纖維細胞CAFs和A549細胞上的一種應激蛋白—葡萄糖調節(jié)蛋白78(GRP7

2、8)為研究靶點，來探索CAFs是否參與了肺癌細胞對紫杉醇(PTX)的耐藥，CAFs是否引起A549細胞GRP78表達的改變，以及由CAFs引起的耐藥是否由A549細胞GRP78所介導，進而為臨床上改善肺癌的耐藥提供導向作用。
　　方法:本實驗通過微流控芯片平臺對肺癌的耐藥機制進行探索，該裝置包括4個雙層微流控芯片單體和16個MS26注射泵，每個微芯片單體由一個雙層芯片和4個MS26注射器構成。上層芯片用來培養(yǎng)成纖維細胞以及供給下層

3、所培養(yǎng)細胞（腫瘤細胞）所需的流動新鮮培養(yǎng)基。成纖維細胞的分泌物以及由MS26注射泵持續(xù)泵入的新鮮培養(yǎng)基可以通過上下層之間的孔道流入下層的腫瘤細胞培養(yǎng)池，為腫瘤細胞的培養(yǎng)創(chuàng)造了接近體內真實狀態(tài)的微環(huán)境。下層芯片主要用來實現藥敏檢測、熒光分析以及腫瘤細胞的三維培養(yǎng)。下層芯片由濃度梯度發(fā)生器和腫瘤細胞培養(yǎng)單元構成，通過將細胞懸液凝膠混合物注入細胞培養(yǎng)池來實現三維培養(yǎng)體系，不同濃度的化療藥物經濃度發(fā)生器后產生4種不同的工作濃度作用于下游的腫瘤細

4、胞，進一步對腫瘤細胞進行凋亡染色、蛋白定量及統(tǒng)計分析得到最終實驗結果。本實驗同時也于大體平臺對蛋白定量分析進行了Western blot檢測，對于芯片平臺的蛋白含量檢測所得的熒光結果進行了驗證。將人肺腺癌細胞A549隨機分為單培養(yǎng)組（單一A549）、共培養(yǎng)組（A549與CAFs）、抑制共培養(yǎng)組（同時加入GRP78抑制劑BAPTA-AM）、誘導共培養(yǎng)組（同時加入GRP78誘導劑A23187）。采用凋亡染色方法檢測各實驗組中A549細胞對不

5、同濃度的紫杉醇(PTX)的藥物敏感情況。通過芯片平臺免疫熒光及大體平臺Western blot對各組A549細胞GRP78的表達進行檢測。根據不同組A549細胞暴露在PTX下的凋亡率變化及GRP78表達水平，來探索CAFs是否參與了A549細胞對PTX的耐藥，CAFs對A549細胞GRP78表達的影響，同時，通過上調或下調GRP78的表達后檢測A549細胞對PTX的細胞凋亡率，來進一步說明CAFs引起的A549細胞對PTX的耐藥是否由A

6、549細胞GRP78所介導。
　　結果:本實驗成功設計的雙層微流控芯片系統(tǒng)實現了CAFs與A549的共培養(yǎng)，化療藥物及空白培養(yǎng)基經濃度發(fā)生器混合后可產生4∶3∶1∶0的濃度梯度，細胞培養(yǎng)單元使細胞實現了三維培養(yǎng)。通過對比傳統(tǒng)平臺與芯片平臺對蛋白含量檢測的實驗結果，充分說明芯片平臺的可靠的應用價值。單培養(yǎng)組與共培養(yǎng)組對比示:1.與CAFs共培養(yǎng)后，A549細胞對PTX的敏感性較A549單獨培養(yǎng)時低(p＜0.05)，說明CAFs促進A

7、549細胞對PTX的耐藥。2.與CAFs共培養(yǎng)后，A549緬胞的GRP78表達升高(p＜0.05)，說明CAFs誘導了A549細胞GRP78的表達。共培養(yǎng)組、抑制共培養(yǎng)組、誘導共培養(yǎng)組結果比較顯示:抑制GRP78的表達后，A549細胞對PTX的敏感性較共培養(yǎng)組升高(p＜0.05);誘導GRP78的表達后，A549細胞對PTX的敏感性較共培養(yǎng)組降低(p＜0.05);說明GRP78參與了A549緬胞對PTX的耐藥。根據上述結果，我們可推斷出