內皮型一氧化氮合酶運輸誘導物的表達在妊娠期高血壓疾病發(fā)病機制中的作用的實驗研究.pdf

1、第一部分妊娠期高血壓疾病患者胎盤組織中內皮型一氧化氮合酶運輸介導物表達的研究 目的:通過測定妊娠期高血壓疾病孕婦胎盤組織中內皮型一氧化氮合酶運輸介導物(NOSTRIN)及內皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表達，探討NOSTRIN在妊娠期高血壓疾病發(fā)病中的作用機制。 方法:逆轉錄－聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測23例妊娠期高血壓疾病患者(病例組)和17例正常晚孕婦女(正常組)胎盤組織中NOSTRINmRNA的表達；West

2、ernblot檢測胎盤組織中NOSTRIN和eNOS蛋白質的表達；免疫組化染色法檢測胎盤組織中NOSTRIN的表達，通過高清晰度彩色醫(yī)學圖文分析系統(tǒng)對其定量分析；HE染色觀察胎盤絨毛血管病變；分光光度法測定胎盤組織中eNOS的活性；硝酸還原酶法測定胎盤組織中和外周血中的NO代謝產物亞硝酸基/亞硝基(NO2-/NO3-)。 結果:病例組胎盤組織中NOSTRINmRNA呈強表達，明顯高于正常組(P＜0.01)；Westernblot

3、顯示兩組胎盤組織中均有58kDa的NOSTRIN蛋白質表達，但病例組表達量明顯增高(P＜0.01)，同時也均有145kDa的eNOS蛋白質表達，兩組比較表達量無差異(P＞0.05)；免疫組化染色定量分析發(fā)現(xiàn)，NOSTRIN在病例組胎盤組織中的表達明顯高于正常組(P＜0.01)；HE染色可見病例組胎盤細小血管壁增厚，管壁纖維素樣壞死發(fā)生率顯著高于正常組(P＜O.01)；病例組患者胎盤組織eNOS活性(13.727±3.58U/mg)與正常

4、組(21.69±3.84U/mg)比較降低顯著(P＜0.01)；病例組孕婦胎盤組織中的NO2-/NO3-(27.53±7.48μmol/mg)與正常組(54.27±9.53μmol/mg)比較顯著降低(P＜0.01)；病例組孕婦外周血清NO2-/NO3-(38.56±8.49μmol/l)與正常組(65.37±9.61μmol/l)比較顯著降低(P＜0.01)；病例組胎盤組織中NOSTRN表達水平與eNOS活性呈負相關(r=-0.57，

5、P＜0.01)。 結論:妊娠期高血壓疾病患者胎盤組織中NOSTRIN表達水平明顯升高，eNOS活性降低，這可能在妊娠期高血壓疾病的發(fā)病中起重要作用。 第二部分NOSTRIN基因克隆及其在HUVEC中的表達 目的:構建內皮型一氧化氮合酶運輸介導物(endothelialnitricoxidesynthasetrafficinducer,NOSTRIN)基因的真核表達載體，通過質粒用NOSTRIN真核表達載體轉染人

6、臍靜脈內皮細胞(humanumbilicalveinendothelialcells,HUVEC)獲得高表達NOSTRIN基因的細胞克隆。 方法:以質粒pcDNA3.1為載體，將NOSTRINcDNA插入后得到NOSTRIN真核表達載體。采用脂質體介導將重組質粒導入體外培養(yǎng)的HUVEC，Westernblot檢測轉染細胞和未轉染細胞中NOSTRIN蛋白質的表達。 結果:酶切電泳和基因測序證實，成功構建了真核表達載體pcD

7、NA3.1-NOSTRIN。并用脂質體介導的方法獲得了高穩(wěn)定表達NOSTRIN的細胞克?。籛esternblot顯示轉染前后的細胞均有58KD的蛋白質表達，轉染后表達量明顯增高。 結論:重組質粒pcDNA3.1-NOSTRIN經轉染能在HUVEC細胞中高效表達，為進一步研究NOSTRIN對HUVEC的生物學影響奠定了基礎。 第三部分NOSTRIN基因高表達誘導臍靜脈內皮細胞生物活性改變的研究 目的:研究人內皮型

8、一氧化氮合酶運輸介導物(endothelialnitricoxidesynthasetrafficinducer,NOSTRIN)基因在體外培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞(humanumbilicalveinendothelialcells，HUVEC)中的過度表達對該細胞生物學特性的影響。 方法:脂質體法將pcDNA3.1-NOSTRIN真核表達載體及空載體分別轉染體外培養(yǎng)的HUVEC，并設未轉染細胞為對照組，G418篩選陽性克隆。免

9、疫組織化學法檢測NOSTRIN的表達部位及FⅧRAg的表達；Westernblot檢測上述處理細胞中NOSTRIN和eNOS蛋白質的表達；分光光度法和硝酸還原酶法分別測定細胞培養(yǎng)上清中eNOS的活性和NO代謝產物亞硝酸基/亞硝基(NO2-/NO3-)水平；光鏡、電鏡觀察細胞的形態(tài)和超微結構。 結果:免疫組織化學證實轉染前后細胞均為血管內皮來源細胞，三組均在細胞膜和胞漿表達NOSTRIN；Westernblot顯示細胞轉染前后均表

10、達58KD的NOSTRIN，但轉染pcDNA3.1-NOSTRIN后表達量明顯增高，同時也均有145KD的eNOS蛋白質表達，表達量無差異(P＞0.05)；轉染pcDNA3.1-NOSTRIN細胞培養(yǎng)上清eNOS活性(11.727±3.09U/ml)與未轉染細胞(22.69±3.36U/ml)和對照組細胞(21.85±3.47U/ml)比較降低顯著(P＜0.01)，同時轉染pcDNA3.1-NOSTRIN細胞培養(yǎng)上清中NO2-/NO3-

11、為(25.56±2.49μmol/l)，與未轉染細胞(48.37±2.61μmol/l)和對照組(49.06±2.78μmol/l)比較顯著降低(P＜0.01)；光鏡和電鏡觀察看到轉染NOSTRIN后對HUVEC有損傷作用(HUVEC拉長、微絨毛變短、細胞膜損傷，胞漿內有脂滴空泡，核膜不完整)。 結論:NOSTRIN的高表達影響了HUVEC的生物學特性，對HUVEC有明顯的損傷作用，這可能是妊娠期高血壓疾病發(fā)病重要環(huán)節(jié)之一。

12、 第四部分TNF-a上調人臍靜脈內皮細胞中NOSTRIN基因的表達 目的:探討腫瘤壞死因子-a(TNF-a)對人臍靜脈內皮細胞中內皮型一氧化氮合酶運輸介導物(NOSTRIN)基因表達的調控作用。 方法:將培養(yǎng)的內皮細胞分為3組：1組為用妊娠期高血壓疾病患者(HDCP)血清作用的臍靜脈內皮細胞，2組為用正常晚孕婦女血清作用的臍靜脈內皮細胞，3組為無任何處理的HUVEC。用逆轉錄－聚合酶鏈反應檢測兩組細胞中NOSTRI

13、NmRNA的表達。酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測HDCP患者和正常孕婦血清中TNF-a含量。用1ng/ml、3ng/ml、5ng/ml3種濃度的TNF-a分別作用HUVEC細胞株6h，以及用濃度為3ng/ml的TNF-a作用HUVEC細胞分別長達6h、12h、24h，逆轉錄－聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測NOSTRINmRNA的表達；將二硫代氨基甲酸吡硌烷(PDTC，5mmol/ml)與TNF-a(3ng/ml)同時作用以及TNF

14、-a(3ng/ml)單獨作用HUVEC細胞6h，RT-PCR檢測NOSTRIN基因mRNA的表達。 結果:三組細胞中都有NOSTRIN表達，1組表達量顯著高于2組和3組(P＜0.01)。ELISA結果顯示，HDCP患者血清中TNF-a含量顯著高于正常晚孕婦女(P＜0.01)。TNF-a作用HUVEC細胞后NOSTRIN表達顯著高表達，并成時間和劑量依賴關系(P＜0.01)。PDTC和TNF-a同時作用的HUVEC和TNF-a單獨