發(fā)酵制備乙醇過程的模擬優(yōu)化與性能監(jiān)控研究.pdf

1、南京工業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文發(fā)酵制備乙醇過程的模擬優(yōu)化與性能監(jiān)控研究姓名：楊小健申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：生物化工指導(dǎo)教師：歐陽平凱200811摘要性顯著高于相應(yīng)的烷烴溶劑。分析十四烷和十二醇對(duì)YPl細(xì)胞形態(tài)的影響可見，十四烷存在下能增加細(xì)胞的比表面積，而十二醇存在下導(dǎo)致了細(xì)胞比表面積的減小，推測(cè)與溶劑的細(xì)胞毒性差異有關(guān)。(4)分離純化得到電泳純的YPl耐有機(jī)溶劑蛋白酶，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了表征。通過硫酸銨沉淀、疏水及強(qiáng)陽離子交換層析，得到電

2、泳純的YPl蛋白酶，比活力提高了372倍，總蛋白回收率達(dá)20％。分離純化產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)顯示亞基分子質(zhì)量約為28kDa，以酪蛋白為底物時(shí)，YPl蛋白酶的‰為O048嘰。純化的YPl蛋白酶對(duì)高達(dá)50％(v／，v)濃度的12種有機(jī)溶劑具有高度的穩(wěn)定性，尤其對(duì)親水性溶劑DMF和DMSO的最大耐受濃度分別高達(dá)55％和65％(v／v)，揭示其具有良好的有機(jī)相催化潛力。YPl蛋白酶在pH80130內(nèi)的具有較高活力和穩(wěn)定性，

3、最適反應(yīng)pH為100，為迄今報(bào)道的最耐堿的溶劑穩(wěn)定性蛋白酶；YPl蛋白酶最適反應(yīng)溫度為55℃，45℃以下時(shí)具有良好的穩(wěn)定性。還原劑對(duì)酶活有輕微的抑制作用，低濃度變性劑尿素(Urea)對(duì)酶活具有較強(qiáng)的促進(jìn)作用。YPl蛋白酶具有絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶的特性，對(duì)表面活性劑mon、SDS、T1)Ireen等均具有較強(qiáng)的抗性。YPl蛋白酶的耐堿特性及對(duì)表面活性劑的抗性，揭示其具有洗滌劑添加領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。(5)克隆了Ⅵ，1耐有機(jī)溶劑蛋白酶基因，

4、并在B口c講淞J“6餅珊wB800中進(jìn)行表達(dá)，驗(yàn)證了表達(dá)蛋白的溶劑耐受性?？寺×税▎?dòng)子、信號(hào)肽的蛋白酶基因，且，f如鯽咖，垅西YPl堿性蛋白酶的閱讀框與B，f砌P刀咖，朋豇ATCCl4580菌株堿性蛋白酶kerA的堿基同源性為964％，氨基酸同源性為987％，其氨基酸突變位點(diǎn)共有5個(gè)，其中Glu85_Lys85的改變發(fā)生在Ⅶl蛋白酶的前肽序列，成熟蛋白酶的氨基酸變化共有4處，分別為T)，r126Phel26，ASnl91Serl91

5、，Pr0233一Ala233，Ser316_Asn316。采用枯草桿菌克隆載體pHY300PLK，利用YPl蛋白酶自身的啟動(dòng)子、RBS、信號(hào)肽、前肽、成熟肽等功能序列在區(qū)J“6耐淞WB800中進(jìn)行了表達(dá)，重組菌能正確識(shí)別并分泌表達(dá)YPl蛋白酶，培養(yǎng)基上清中蛋白酶活力高達(dá)150U，是含有pHY300PLK空載體對(duì)照菌株蛋白酶活力的8—10倍，重組菌所表達(dá)的蛋白酶對(duì)多種50％(v～)的親水或疏水溶劑均有良好的耐受性。耐有機(jī)溶劑YPl蛋白酶編