芍藥苷對缺血性腦水腫的防治作用及其作用機(jī)制研究.pdf

1、腦水腫(BrainEdema，BE)為腦損傷疾病的早期的一個(gè)重要病理變化，直接關(guān)系到疾病的轉(zhuǎn)歸和愈合，缺血性腦水腫(IschemicBrainEdema，IBE)是腦組織血管阻塞、血管痙攣或窄小引起血流不暢致腦組織供血不足引起缺血缺氧，發(fā)生病理性腦實(shí)質(zhì)內(nèi)水分異常增加的一種病變。1967年，Klatzo首先將腦水腫定義為腦實(shí)質(zhì)內(nèi)液體異常聚積導(dǎo)致組織體積增加，從發(fā)病機(jī)制和病理方面將腦水腫分為血管源性和細(xì)胞毒性腦水腫，之后其他學(xué)者又提出了間質(zhì)

2、性腦水腫、滲透性腦水腫、流體性腦水腫概念等。 缺血性腦水腫的嚴(yán)重程度、治療的及時(shí)性密切關(guān)系到中風(fēng)后遺癥的輕重和患者的恢復(fù)程度。腦卒中是神經(jīng)系統(tǒng)的常見病和多發(fā)病，是目前人類疾病的三大死亡原因之一，且存活者中50-70％的病人遺留癱瘓、失語等嚴(yán)重殘疾，給社會(huì)和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)，而其中缺血性腦卒中即腦梗死約占全部腦卒中的80％。所以，提高缺血性腦水腫的治療決策水平，對更有效地治療腦梗死以降低其死亡率和致殘率，提高患者的生活質(zhì)量具有非

3、常重大的意義。 腦梗死后腦水腫治療方法包括血壓的正確管理，高滲療法，低溫療法，外科手術(shù)減壓，吲哚美辛、皮質(zhì)類固醇、巴比妥類等藥物治療及一般原則治療。藥物治療常以甘露醇、速尿等脫水劑為主，也采用鈣離子拮抗劑、糖皮質(zhì)激素類等作用還沒有定論的相關(guān)藥物。中藥對腦水腫的治療效果已十分明確，丹參、紅花、三七等制備的注射劑已在臨床廣泛應(yīng)用，從婆羅子中提取有效單體的β-七葉皂苷鈉注射液不失為中藥治療腦水腫的一個(gè)典范。 赤芍為毛茛科植物芍

4、藥(PaeonialactifloraPall)或川赤芍(PaeoniaveitchiiLynch)的干燥根，屬清熱涼血藥，性味苦、微寒，歸肝經(jīng)，具有清熱涼血、散瘀止痛之功能。藥理研究表明赤芍對心血管、腦缺血、腫瘤、肝臟等均有明顯藥理作用。經(jīng)從赤芍提取赤芍總苷(TotalPaeonyGlycoside，TPG)，體內(nèi)外研究表明赤藥總苷有較強(qiáng)的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用，對動(dòng)物腦缺血模型有明顯的防治作用，可明顯抑制腦缺血?jiǎng)游锬X水腫的發(fā)生?，F(xiàn)進(jìn)一步從

5、赤芍中提取獲得芍藥苷(PaeoniflorinPF，PF)，本研究旨在觀察PF對缺血性腦水腫的防治作用及其作用機(jī)制，為進(jìn)一步開發(fā)用于治療缺血性腦水腫藥物PF提供藥理學(xué)依據(jù)。研究結(jié)果概述如下： 1、芍藥苷對缺血再灌注損傷小鼠腦指數(shù)和腦血管透性的影響取昆明小鼠70只，隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型對照組，PF15mg/kg、45mg/kg、135mg/kg組和血栓通注射液90mg/kg組。實(shí)驗(yàn)前三天每天尾靜脈注射一次。末次給藥后，用烏拉坦麻

6、醉，固定，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，給藥后30min阻斷血流，缺血30min后再灌注，再灌同時(shí)股靜脈注射100mg/kg伊文思藍(lán)。缺血180min后斷頭，取大腦，稱重后剪碎，提取腦組織中伊文氏藍(lán)，用分光光度計(jì)于620nm處測吸光度，以此反映給藥對腦血管通透性的影響。 試驗(yàn)結(jié)果表明缺血再灌注小鼠腦指數(shù)和腦組織中伊文氏藍(lán)明顯大于假手術(shù)組。PF15mg/kg、45mg/kg、135mg/kg三個(gè)劑量組腦指數(shù)和腦組織中伊文氏藍(lán)含量均有顯著的降低

7、作用(P＜0.01)。提示PF可以通過抑制小鼠腦缺血再灌注損傷引起腦血管通透性增加，從而降低腦指數(shù)。 2、芍藥苷對小鼠反復(fù)缺血再灌注損傷腦水腫的影響取昆明小鼠70只，隨機(jī)分組為PF15mg/kg、45mg/kg、135mg/kg組，血栓通注射液90mg/kg組，模型對照組和假手術(shù)組。于實(shí)驗(yàn)前三天，每天注射給藥一次，末次給藥后用烏拉坦麻醉，固定，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，穿線備用。給藥30min后阻斷血15min再復(fù)灌15min，再缺血1

8、5min，抽出手術(shù)線，造成反復(fù)缺血再灌注模型。24小時(shí)后斷頭，觀察斷頭后呼吸時(shí)間和呼吸次數(shù)，并剝?nèi)〈竽X，稱重，計(jì)算腦指數(shù)；于105℃烘箱烘至恒重，計(jì)算腦含水量。 試驗(yàn)結(jié)果表明反復(fù)缺血再灌損傷24小時(shí)后的小鼠呼次數(shù)與時(shí)間明顯小于假手術(shù)組，PF15mg/kg、45mg/kg、135mg/kg三個(gè)劑量組與血栓通注射液組均可顯著或極顯著提高呼吸次數(shù)和延長呼吸時(shí)間(P＜0.05或P＜0.01)。腦含水量測定結(jié)果表明造模組腦指數(shù)和腦含水量同

9、假手術(shù)組沒有明顯差異，提示反復(fù)缺血再灌注15min模型小鼠24小時(shí)后腦水腫可能已自發(fā)恢復(fù)。 3、芍藥苷對MCAO大鼠腦水腫的影響取雄性SD大鼠230-260g，隨機(jī)分成假手術(shù)組，模型組，PF10mg/kg、30mg/kg、90mg/kg三個(gè)劑量組，血栓通注射液60mg/kg組。術(shù)前三天腹腔注射給藥，每天一次。末次給藥后30min將大鼠用10％水合氯醛麻醉，分離、結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈，參照Berdson法用4-0尼龍線阻斷大腦中動(dòng)脈。

10、假手術(shù)組除不插線外，其余步驟相同。術(shù)后4h給藥一次。造模成功能夠存活24h的大鼠確定為最后實(shí)驗(yàn)對象，并進(jìn)行行為學(xué)評分后，快速取右腦，冰凍25分鐘。然后冠狀切兩刀，全腦切成三部分。腦前部用含水量測定，中部用于腦梗死重量百分比測定，后部用于病理組織學(xué)檢查和免疫組化染色。 試驗(yàn)結(jié)果表明：模型對照組大鼠腦缺血24h后出現(xiàn)明顯的神經(jīng)損傷癥狀，腦組織含量水明顯增加。PF10mg/kg、30mg/kg、90mg/kg三個(gè)劑量組均可顯著降低神經(jīng)

11、行為學(xué)評分(P＜0.05或P＜0.01)和腦含水量。TTC染色結(jié)果可見假手術(shù)組腦組織無明顯梗死，模型對照組缺血側(cè)腦組織有明顯梗死現(xiàn)象，梗死區(qū)占整個(gè)腦片重的24.81％，PF三個(gè)劑量組和血栓通注射液組均可顯著縮小缺血側(cè)腦組織梗塞體積，與模型組對照組相比有顯著性差異(P＜0.01)。 通過HE染色和免疫組化染色觀察缺血性腦水腫大鼠腦組織病理學(xué)改變和水通道蛋白-4的表達(dá)。結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，胞漿豐富，細(xì)胞核清

12、晰，可見尼氏小體，腦皮質(zhì)和海馬區(qū)細(xì)胞AQP4染色呈弱陽性。模型組大鼠腦組織鏡下可見明顯片狀軟化灶，間質(zhì)疏松，水腫明顯，多數(shù)細(xì)胞腫脹變性、著色加深；腦組織小血管及毛細(xì)血管周圍間隙明顯變寬；免疫組化染色結(jié)果顯示造模型動(dòng)物梗塞區(qū)周圍皮質(zhì)的陽性細(xì)胞數(shù)量增多，周圍半暗帶更加明顯，軟化灶呈不完整的陽性細(xì)胞。同模型組比較，用藥組對MCAO大鼠腦組織和神經(jīng)細(xì)胞的病理損傷有較好的改善，用藥組AQP4陽性細(xì)胞的表達(dá)明顯減少，以PF30mg/kg、90mg/

13、kg劑量組和血栓通注射液組較為明顯。 本實(shí)驗(yàn)提示PF可明顯降低缺血性大鼠腦組織含水量，抗腦水腫作用可能是通過抑制AQP4的表達(dá)。同時(shí)表明PF可能通過抑制腦水腫的發(fā)生，而顯著改善局灶性腦缺血損傷大鼠的神經(jīng)損傷癥狀和腦組織神經(jīng)細(xì)胞損傷。 4、PF對沙土鼠全腦缺血再灌注損傷的影響取沙土鼠60只，隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，血栓通注射液組，PF10mg/kg、30mg/kg、90mg/kg三個(gè)劑量組。造模前30min靜脈給藥后，以

14、10％水合氯醛(3.5ml/kg，i.p.)麻醉沙土鼠。將麻醉沙土鼠仰臥固定，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈并穿縫線，用無創(chuàng)動(dòng)脈夾阻斷血流12min后再恢復(fù)血流24h，造成沙土鼠腦缺血再灌注損傷模型。造模后6h和12h進(jìn)行靜脈注射給藥兩次，縫合皮膚傷口，手術(shù)完畢回籠飼養(yǎng)。假手術(shù)組沙土鼠只分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，不結(jié)扎。沙土鼠造模后24h快速取全腦，取左側(cè)腦前半部分稱濕重，用于腦含水量測定；取右側(cè)半腦前半部分用于Glu和Asp測定；取右側(cè)半腦海馬組織稱重，用

15、于進(jìn)行腺苷含量測定；取左側(cè)腦前中間部分小部分放入4％多聚甲醛磷酸鹽緩沖液保存，進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)及細(xì)胞間質(zhì)變化。 試驗(yàn)結(jié)果表明全腦缺血再灌注24小時(shí)后模型組沙土鼠腦組織含水量明顯升高，與假手術(shù)組相比差異非常顯著(P＜0.01)；PF注射液30mg/kg、90mg/kg組和血栓通注射液與模型組對比均有顯著性降低(P＜0.05或P＜0.01)。腦組織中Glu、Asp和腺苷含量測定結(jié)果顯示沙土鼠缺血再灌注后模型組

16、明顯升高(P＜0.01)，PF用藥組升高值明顯低于模型組(P＜0.05或P＜0.01)，血栓通組同樣明顯低于模型組。 組織病理學(xué)檢查結(jié)果表明假手術(shù)組鼠腦神經(jīng)元的大小和形態(tài)基本正常，胞核完整，核仁清晰。海馬CA1區(qū)細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞帶寬，約有5～7層細(xì)胞，胞核居中，胞質(zhì)豐富，著色均勻；模型組大鼠多數(shù)樣本可見細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，腫脹，核固縮，深染。海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，胞體變小，胞質(zhì)不均，部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡，胞核固縮深染，核仁消失

17、；用藥組與模型組比較有不同程度改善，30mg/kg、90mg/kg組和血栓通注射液組，多數(shù)神經(jīng)元的形態(tài)和結(jié)構(gòu)基本正常，只見部分樣本可見細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，部分核固縮，染色加深，核仁不清。海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞輕度排列紊亂，細(xì)胞體積稍變小，形態(tài)改變，部分胞核固縮深染，核仁不清，細(xì)胞周圍間隙略增寬 提示PF可能通過抑制興奮性氨基酸的釋放，保護(hù)腦細(xì)胞，對缺血再灌注損誘發(fā)腺苷的釋放的抑制作用，防止腺苷釋放過多引起副作用，從而抑制全腦缺血再灌注

18、性腦水腫的發(fā)生和神經(jīng)細(xì)胞損傷。 綜上所述，芍藥苷可明顯抑制梗塞性腦水腫和缺血再灌注損傷腦水腫均有明顯抑制作用。作用途徑可能通過調(diào)節(jié)水道蛋白AQP4的表達(dá)；調(diào)節(jié)腦缺血時(shí)機(jī)體自身腺苷濃度；抑制興奮性氨基酸Glu和Asp的釋放。芍藥苷為從赤藥中提取的有效單一成分，較成分復(fù)雜不明的中藥復(fù)方制劑更有利于質(zhì)量控制，如將其開發(fā)為注射劑應(yīng)用于急癥缺血性腦卒中，可在發(fā)作早期介入治療防止或減輕水腫的發(fā)生，對患者的愈后有十分積極的意義，便可產(chǎn)生良好的