宮頸上皮內(nèi)瘤變中E-cadherin，β-catenin的表達(dá)與HPV16-18感染的關(guān)系.pdf

1、宮頸癌(cervical cancer，CC)是婦女最常見的惡性腫瘤之一，現(xiàn)已確認(rèn)高危型人乳頭瘤病毒(high risk human papillomavirus，HR—HPV)是宮頸癌形成最重要的危險(xiǎn)因子，99.7％的浸潤性宮頸癌中可以檢測(cè)到HR—HPV的存在。因此，通過高危HPV的檢測(cè)來篩查易患人群，追蹤HPV感染狀態(tài)，隨訪HPV是否被清除，是預(yù)防宮頸癌發(fā)生的關(guān)鍵。但并非所有感染HPV的患者都會(huì)發(fā)展為宮頸癌，僅檢測(cè)到患者感染了HPV

2、而不進(jìn)一步檢查就無法了解宮頸病變的程度和發(fā)展趨勢(shì)。E—cadherin是一類介導(dǎo)細(xì)胞—細(xì)胞間黏附、具有維持組織結(jié)構(gòu)完整性和極性的鈣依賴性跨膜蛋白。E—cad的功能不僅需鈣離子存在，還需要與其配體連接素(catenin，cat)結(jié)合成復(fù)合體才能起作用，β—cat與E—cad直接結(jié)合，α—cat介導(dǎo)E—cad/β—cat與細(xì)胞骨架的肌動(dòng)蛋白相連。故對(duì)維持上皮細(xì)胞的極性及分化起到重要作用，E—cadherin功能下降或缺失可能導(dǎo)致細(xì)胞—細(xì)胞間

3、黏附作用的降低，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，發(fā)展．在宮頸上皮內(nèi)病變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)和宮頸癌中呈低表達(dá)，在正常對(duì)照組高表達(dá)，因此如果通過對(duì)宮頸癌病因?qū)W因素HPV和生物標(biāo)志物因素E—cadherin，β—catenin的聯(lián)合檢測(cè)，來對(duì)宮頸癌高危人群進(jìn)行篩查，可能具有重要意義。本研究對(duì)93例宮頸液基細(xì)胞殘液標(biāo)本應(yīng)用導(dǎo)流雜交HPV—DNA檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)HPV各亞型的表達(dá)，并對(duì)相應(yīng)組織組織學(xué)標(biāo)

4、本用免疫組化法檢測(cè)E—cadherin，β—catenin，以探討二者在子宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)意義及臨床應(yīng)用價(jià)值，試圖為提高宮頸癌易患人群檢出率，進(jìn)而為宮頸癌的預(yù)警和早期診斷提供更科學(xué)有效的方法，達(dá)到早診早治，降低宮頸癌發(fā)病率死亡率的目的；并為開發(fā)簡(jiǎn)便易得的分子篩查技術(shù)資源提供理論基礎(chǔ)。 材料和方法: 一、材料 (一)研究對(duì)象 600例宮頸液基細(xì)胞學(xué)殘液標(biāo)本，均經(jīng)LCT(Liquid—based Cy

5、tology Test，LCT系統(tǒng))診為宮頸上皮內(nèi)病變及宮頸癌，來自2007年9月～2008年10月中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科。無宮頸手術(shù)史、未孕、無盆腔放射治療史，年齡26～77歲，平均年齡48.4歲。40例子宮頸癌、40例CIN患者及13例對(duì)照組其中子宮頸浸潤癌40例、CINⅡ—Ⅲ19例、CINⅠ21例。 (二)主要試劑、儀器和來源 鼠抗人HPV16/18 E6抗體和羊抗鼠IgG—HRP抗體，鼠抗人E—cadher

6、in，β—catenin抗體均購自美國Santa Cruz公司。HPV—DNA分型檢測(cè)試劑盒購自凱普公司。免疫組化S-P試劑盒和DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。 二、方法 (一)免疫組織化學(xué)染色 用鏈霉素抗生物素蛋白—過氧化物酶免疫組化法(S-P法)檢測(cè)E—cadherin，β—catenin的表達(dá)。結(jié)果判定：E—cadherin，β—catenin蛋白定位于細(xì)胞膜，胞膜內(nèi)見棕黃色顆粒為陽性。由3名

7、有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師在雙盲法下獨(dú)立計(jì)數(shù)。細(xì)胞涂片主要計(jì)數(shù)有病變的細(xì)胞，異常宮頸上皮細(xì)胞著色大于10％則判定為陽性標(biāo)本[5]。細(xì)胞片和組織片在光鏡下根據(jù)著色范圍分為：陽性細(xì)胞數(shù)小于10～24％為(+)；陽性細(xì)胞數(shù)25～49％為(++)；陽性細(xì)胞數(shù)50～74％為(+++)；陽性細(xì)胞數(shù)大于75％為(++++)。 (二)原位雜交 檢測(cè)HPV16/18DNA的表達(dá)。細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。陽性細(xì)胞數(shù)小于25％為(+)；陽性細(xì)胞數(shù)

8、25％～49％為(++)；陽性細(xì)胞數(shù)50％～74％為(+++)；陽性細(xì)胞數(shù)75％～100％為(++++)． (三)導(dǎo)流雜交HPV—DNA分型檢測(cè) 檢測(cè)HPV—DNA各亞型的表達(dá)．在檢測(cè)結(jié)果模板上相應(yīng)亞型區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)實(shí)心圓點(diǎn)即為該亞型陽性表達(dá)． (四)western HPV蛋白提?。簩⑹⒂袠颖镜脑嚬苤糜谒楸?，用超聲破碎機(jī)破碎細(xì)胞，4℃12000/g離心，45 min。取上清液，定量、備用。電泳、顯色：采用

9、十二烷基硫酸鈉變性聚丙烯酰胺凝膠不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，先后配制15％的分離膠和5％濃縮膠；取蛋白樣品，上樣20μl(約含蛋白60μg)，電泳后將醋酸纖維素膜鋪到膠上進(jìn)行轉(zhuǎn)印，42v，2h．加入一抗(1：200)過夜，加入二抗(1：2000)37℃，DAB顯色3～5 min。該膜上有顯色帶出現(xiàn)為陽性；若無顯色，為陰性表現(xiàn)。 (五)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 對(duì)所得結(jié)果各組間采用X2檢驗(yàn)及Fisher's確切概率法檢驗(yàn)，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

10、 結(jié)果: 一、免疫組化法檢測(cè)E—cadherin，β—catenin的表達(dá) E—cadherin，在細(xì)胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，β—catenin在細(xì)胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，過表達(dá)時(shí)胞核胞漿均著色，周圍正常結(jié)締組織、血管、間質(zhì)細(xì)胞顯示弱的著色。 E—cadherin，在正常宮頸脫落細(xì)胞及宮頸組織中高表達(dá)，在各組宮頸病變中有不同程度的表達(dá)：E—cadherin，在正常，CIN，浸潤癌中的表達(dá)率分別為8

11、4.6％(11/13)，72.5％(29/40)，27.5％(11/40)，β—catenin在正常，CIN，浸潤癌中的表達(dá)率分別為76.9％(10/13)，67.5％(27/40)，32.5％(13/40)。隨著宮頸上皮病變程度的加重呈現(xiàn)減低的趨勢(shì) 二、原位雜交法檢測(cè)HPV16/18 DNA的表達(dá) HPV16/18在細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，部分病例可在胞漿中見到棕黃色顆粒。 HPV16/18在正常宮頸脫落

12、細(xì)胞中及相應(yīng)組織中不表達(dá)或弱表達(dá)，在各組宮頸病變中有不同程度的表達(dá)：在正常、CIN和宮頸癌中，HPV16/18的陽性率分別為15.4％(2/13)、50.0％(20/40)和82.5％(33/40)，隨著宮頸上皮病變程度的加重呈現(xiàn)增高的趨勢(shì)。 三、導(dǎo)流雜交HPV—DNA分型檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)HPV各亞型的表達(dá) HPV—DNA各亞型在檢測(cè)結(jié)果模板相應(yīng)亞型區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)實(shí)心圓點(diǎn)，即為該亞型陽性． HPV—DNA各亞型在正常宮頸

13、脫落細(xì)胞中不表達(dá)或弱表達(dá)，在各組宮頸病變中有不同程度的表達(dá)：600例患者HPV檢測(cè)陽性共245例，陽性率為40.83％(245/600)，其中包括復(fù)合感染，具體感染情況見表1.表2.在HPV21種亞型中，除了HPV43，HPV44外有19種亞型被檢出，感染率最高的是HPV16(87/245)，其它常見型別為HPV58(36/245)，由此可見我省婦女感染HPV主要亞型是HPV16，HPV58及HPV6。 四、Western法檢測(cè)

14、HPV16/18的表達(dá) HPV16/18在正常、CIN和宮頸癌中，陽性率分別為23.1％(3/13)，62.5％(25/40)，85％(34/40)。隨著宮頸上皮病變程度的加重呈現(xiàn)增高的趨勢(shì)。 結(jié)論: 1.E—cadherin，β—catenin在宮頸上皮內(nèi)病變及宮頸癌中，隨著病變程度的加重而陽性率減低。 2.HPV16/18的陽性率在宮頸上皮內(nèi)病變及宮頸癌中，隨著病變程度的加重而檢出率增高。 3

15、.E—cadherin的表達(dá)和HPV16/18的感染在宮頸病變中呈負(fù)相關(guān)，二者聯(lián)合檢測(cè)可提高宮頸病變篩查的準(zhǔn)確度。 4.Western—blot檢測(cè)HPV16/18E6具有較高的靈敏性，尤其是在CIN組，適合于對(duì)宮頸疑難病例的檢測(cè)，作為HPV16/18檢測(cè)的輔助手段。 5.HPV16/18，在宮頸液基細(xì)胞學(xué)殘液和相應(yīng)組織中的檢測(cè)結(jié)果都是基本一致的，作為宮頸病變檢測(cè)的輔助手段。 6.導(dǎo)流雜交HPV—DNA分型檢測(cè)我