不同急性肝損傷模型大鼠卵圓細(xì)胞生物學(xué)差異及自噬的變化.pdf

1、多種原因均可引起急性肝損傷的發(fā)生，急性肝損傷后的高死亡率和預(yù)后差一直是醫(yī)學(xué)界的難題。目前如何更好地治療肝損傷仍是國內(nèi)外的一個(gè)難點(diǎn)。嚴(yán)重的急性肝功能損傷常引起急性肝功能衰竭，致肝功能不可逆轉(zhuǎn)而危及生命。終末期肝病目前最好的治療方法為原位肝移植，但供體有限及術(shù)后免疫排斥反應(yīng)是兩個(gè)主要的障礙。
　　 卵圓細(xì)胞作為肝臟的干細(xì)胞，在肝損傷的修復(fù)中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，卵圓細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)其增殖率不同，于此提出卵圓細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)增殖動(dòng)力存在

2、差異，EpCAM和PCNA共表達(dá)反應(yīng)卵圓細(xì)胞增殖活性，即各時(shí)間點(diǎn)EpCAM和PCNA共表達(dá)存在差異。卵圓細(xì)胞具有多向分化功能，其可分化為肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞及肝癌細(xì)胞，甚至胰島細(xì)胞等，而在對卵圓細(xì)胞標(biāo)記物的研究中發(fā)現(xiàn)膽管細(xì)胞表達(dá)CK19，肝母細(xì)胞表達(dá)AFP，可進(jìn)行卵圓細(xì)胞分化方向的判斷。判斷卵圓細(xì)胞的分化研究有助于對肝臟疾病治療進(jìn)行評估。
　　 近年，自噬與凋亡的研究是熱點(diǎn)問題。自噬是一個(gè)必不可少的，保守的通過消除蛋白質(zhì)聚集和破壞細(xì)

3、胞器來控制胞漿性質(zhì)的溶酶體降解過程。自噬與凋亡存在密切關(guān)系，兩者相互協(xié)同而對細(xì)胞轉(zhuǎn)歸產(chǎn)生影響。而自噬與凋亡的確切關(guān)系仍存在爭議。卵圓細(xì)胞作為肝臟干細(xì)胞，參與肝臟的再生性修復(fù)及疾病演變，卵圓細(xì)胞是否存在自噬現(xiàn)象與其分化與增殖有無關(guān)聯(lián)？本實(shí)驗(yàn)建立了不同的急性肝損傷模型，對卵圓細(xì)胞在不同情況下增殖及分化有無差異，并對肝損傷修復(fù)中自噬及凋亡進(jìn)行了初步研究。
　　 目的:建立不同的肝卵圓細(xì)胞增殖模型，觀察其增殖、分化的差異及自噬的變化情況

4、。
　　 方法:①選擇健康SD大鼠隨機(jī)分為五組，分別為四氯化碳組、D-gal組、假手術(shù)組、2-AAF/PH組及空白對照組，建立肝損傷模型。分別于1d、7d、14d、21d處死動(dòng)物取肝臟組織。②采用hematoxylin&eosinstaining(H&E染色)觀察大鼠肝組織病理組織學(xué)表現(xiàn)。③免疫熒光技術(shù)觀察不同時(shí)間點(diǎn)卵圓細(xì)胞表達(dá)，對陽性細(xì)胞進(jìn)行定量技術(shù)分析。④免疫熒光雙標(biāo)方法觀察卵圓細(xì)胞增殖動(dòng)力變化。⑤免疫組織化學(xué)方法觀察卵圓細(xì)

5、胞分化標(biāo)記物AFP、CK-19、C-kit的表達(dá)，并對其進(jìn)行定量技術(shù)分析判斷其表達(dá)有無差異。⑥電鏡下觀察卵圓細(xì)胞自噬體超微結(jié)構(gòu)。⑦WesternBlotting技術(shù)觀察自噬標(biāo)記蛋白LC3-Ⅱ蛋白及Beclin-1蛋白表達(dá)。⑧原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測凋亡有無變化。
　　 結(jié)果:①與空白對照組相比，應(yīng)用四氯化碳組大鼠肝臟顏色為暗紅色，質(zhì)脆，約14天后漸恢復(fù)正常;D-gal組大鼠肝臟水腫明顯，色暗紅，質(zhì)脆，約14天后漸恢復(fù)

6、正常;假手術(shù)組大鼠肝臟與之相比未見明顯差異;2-AAF/PH組與之相比，1天肝臟呈淡紅色，質(zhì)脆，約21天后肝臟大小及顏色恢復(fù)正常。②肝臟組織H&E結(jié)果顯示，與空白對照組相比，四氯化碳組、D-gal組及2-AAF/PH組可見肝細(xì)胞腫脹，排列紊亂，于匯管區(qū)周圍可見細(xì)胞形態(tài)小于肝細(xì)胞，核質(zhì)深染，細(xì)胞核呈卵圓形的卵圓細(xì)胞;四氯化碳組和D-gal組炎癥細(xì)胞浸潤明顯比2-AAF/PH組少，卵圓細(xì)胞少。③血清肝功能檢測顯示，大鼠造模完成后第1天肝功能

7、同空白對照組相比，假手術(shù)組肝功能變化無明顯差異。四氯化碳組、D-gal組及2-AAF/PH組大鼠天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartateaminotransferase，AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanineaminotransferase，ALT）及堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)水平明顯升高（AST:133.97±14.35U/Lvs82.47±21.86U/L,P＜0.05;346.17±9.75U

8、/Lvs82.47±21.86U/L，P＜0.05;557.97±12.85U/Lvs82.47±21.86U/L，P＜0.05;ALT:47±9.35U/Lvs41.97±6.64U/L，P＜0.05;102.44±5.04U/Lvs41.97±6.64U/L，P＜0.05;249.1±19.71U/Lvs41.97±6.64U/L,P＜0.05;ALP:270.33±36.09Uvs53.27±8.50U，P＜0.05;379.33

9、±21.55Uvs53.27±8.50U,P＜0.05;520.67±33.02Uvs53.27±8.50U,P＜0.05;），白蛋白(albumin，ALB)水平明顯下降（23.37±2.21g/Lvs32.13±3.73g/L，P＜0.05;22.9±2.50g/Lvs32.13±3.73g/L，P＜0.05;23.9±1.06g/Lvs32.13±3.73g/L，P＜0.05）。四氯化碳組、D-gal組及2-AAF/PH組之間比較

10、，2-AAF/PH組肝功能變化較大。④免疫熒光檢測小鼠抗大鼠OV6抗體表達(dá)顯示:四氯化碳組、D-gal組及2-AAF/PH組對OV6抗體表達(dá)均在1～14天表達(dá)呈上升趨勢，14～21天呈下降趨勢，14天表達(dá)量最高。假手術(shù)組與空白對照組比較表達(dá)無明顯規(guī)律性。四氯化碳組、D-gal組及2-AAF/PH組與空白對照組相比OV6抗體的表達(dá)在術(shù)后1天、7天、14天及21天均明顯增高，尤以14天升高最明顯(109.67±4.04vs5.67±1.53

11、，P＜0.05;154.67±8.02vs5.67±1.53，P＜0.05;292.67±8.50vs5.67±1.53，P＜0.05)，假手術(shù)組表達(dá)無明顯變化(2.67±0.58vs5.67±1.53，P＞0.05)。四氯化碳組、D-gal組及2-AAF/PH組之間相比，2-AAF/PH組對OV6抗體的表達(dá)明顯增高。⑤EpCAM和PCNA熒光雙標(biāo)檢測反映卵圓細(xì)胞增殖動(dòng)力:四氯化碳組、D-gal組及2-AAF/PH組卵圓細(xì)胞增殖率在術(shù)后

12、1天、7天、14天及21天呈下降趨勢，并在術(shù)后7～14天下降明顯，2-AAF/PH組在7天時(shí)為（82.8±2.60）％，在14天則下降至(51.90±2.01)％，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。假手術(shù)組與空白對照組比較無明顯差異。⑥免疫組織化學(xué)染色顯示:與空白對照組相比，四氯化碳組、D-gal組及2-AAF/PH組對AFP、CK19及C-kit的表達(dá)均增加，且為1～14天呈上升趨勢，14天達(dá)高峰值，14～21天呈下降趨勢（AFP、CK19及

13、C-kit四氯化碳組:116.67±3.51vs4.33±2.31，P＜0.05;108.67±6.51vs2.67±0.89,P＜0.05;105.33±4.16vs4.00±1.00，P＜0.05;D-gal組:155.33±5.69vs4.33±2.31,P＜0.05;148.67±6.03vs2.67±0.89,P＜0.05;157.67±3.22vs7.67±2.08，P＜0.05;2-AAF/PH組:265.33±8.08v

14、s4.33±2.31，P＜0.05;261.0±18.68vs2.67±0.89，P＜0.05;236.33±6.51vs4.00±1.00,P＜0.05）。假手術(shù)組與空白對照組比較無明顯變化（4.67±1.15vs4.33±2.31，P＞0.05;3.00±1.00vs2.67±0.89,P＞0.05;3.67±0.58vs4.00±1.00,P＞0.05）。四氯化碳組、D-gal組及2-AAF/PH組對AFP的表達(dá)存在差異（F值為2

15、60.421，P＜0.01）;對CK19的表達(dá)有差異（F值為144.632，P＜0.05）;對C-kit的表達(dá)有差異（F值為273.875，P＜0.05），表現(xiàn)為2-AAF/PH組對AFP、CK19及C-kit的表達(dá)高于其余各組。⑦透射電鏡顯示1天、7天、14天及21天卵圓細(xì)胞內(nèi)均未發(fā)現(xiàn)自噬體。1天時(shí)電鏡下觀察卵圓細(xì)胞體積小，胞核與胞漿比值較高，細(xì)胞器組成為散在明顯的微絲束和較多的核糖體及少許粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，7天到21天觀察卵圓細(xì)胞體積多較

16、1天時(shí)大，此時(shí)含有較多的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及糖元，也可見少量的張力微絲。⑧Westernblot檢測結(jié)果顯示:四氯化碳組、D-gal組及2-AAF/PH組大鼠肝臟組織中Beclin-1及LC3-Ⅱ蛋白隨時(shí)間變化表達(dá)水平明顯增加，各組間對Beclin-1蛋白的表達(dá)存在差異（F值為7.811，P＜0.05），各組間對LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)亦存在差異（F值為27.592，P＜0.05）。假手術(shù)組與空白對照組大鼠肝組織Beclin-1及LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)

17、水平與時(shí)間變化無明顯變化(Beclin-1:F值為0.413，P＞0.05;LC3-Ⅱ:F值為1.173，P＞0.05)。⑨TUNEL檢測結(jié)果顯示:2-AAF/PH組凋亡細(xì)胞表達(dá)在1～14天呈上升趨勢，14～21天凋亡細(xì)胞表達(dá)呈下降趨勢。
　　 結(jié)論:不同模型的急性肝損傷肝臟的損傷程度不同，以2-AAF/PH組為重，四氯化碳組和D-gal組次之。2-AAF/PH組肝臟的修復(fù)通過肝卵圓細(xì)胞的活化來完成。四氯化碳組和D-gal組作為